携带vIL-10的逆转录病毒重组体的构建及体外表达研究

目的构建携带vIL-10表达序列的重组逆转录病毒rRV-vIL-10并检测该重组病毒对体外培养的兔滑膜细胞的转染情况和目的基因的表达水平。方法①设计带有酶切位点的引物,对含有目的基因的质粒进行PCR扩增并纯化目的基因片段。②双酶切目的基因vIL-10与逆转录病毒载体pLXSN,将pLXSN与vIL-10进行定向克隆连接,筛出阳性克隆并进行鉴定。③扩增逆转录病毒重组体rRV-vIL-10,与辅助质粒pVSVG通过磷酸钙-共沉淀法共转染GP-293包装细胞,收集病毒并测定滴度。④将获得的重组逆转录病毒rRV-vIL-10转染体外培养的兔滑膜成纤维样细胞。细胞免疫组化测定目的蛋白的表达。结果①成功构建了携带治疗基因的重组逆转录病毒rRV-vIL-10,病毒滴度为5×106cfu/ml。②rRV-vIL-10能有效转染体外培养的兔滑膜成纤维样细胞,细胞免疫组化法可检测到vIL-10的表达。结论①成功构建了携带治疗基因vIL-10的重组逆转录病毒rRV-vIL-10。②以逆转录病毒为载体可以成功地将vIL-10基因导入体外培养的兔滑膜成纤维样细胞并表达vIL-10蛋白。

vIL-10转基因治疗兔膝关节炎模型的实验研究

目的以逆转录病毒重组体rRV-vIL-10为治疗基因,通过体内外基因转移的动物实验研究,建立局部兔膝关节炎间接体内基因治疗方法。方法①利用可以稳定表达hIL-1β的兔滑膜原代细胞(MFG-hIL-1β-neo-HIG-82)诱导出兔膝关节炎模型。②在体内实验中,将在体外培养的已转染rRV-vIL-10的兔关节滑膜细胞经G418筛选出阳性细胞后回输注入兔膝关节腔内,进行间接体内基因治疗。③通过RT-PCR方法和免疫组化法证实治疗基因转移至体内的滑膜组织并有效表达目的蛋白。④ELISA方法测定关节炎的相关细胞因子在基因治疗前后的水平变化。结果①通过RT-PCR及免疫组化的方法证实逆转录病毒重组体rRV-vIL-10能有效转染兔膝关节的滑膜组织。②应用rRV-vIL-10重组体进行局部间接体内基因治疗可以明显改善hIL-1β诱导的兔膝关节炎模型的关节炎症,下调炎症相关的细胞因子hIL-1β的水平。结论逆转录病毒重组体rRV-vIL-10可以成功地将vIL-10基因导入兔滑膜成纤维样细胞和滑膜组织,明显降低hIL-1β诱导的兔膝关节炎的炎症水平。

急性白血病血管内皮生长因子表达的研究

目的:研究血管内皮生长因子(VEGF)表达与白血病细胞增殖的相关性。方法:应用流式细胞术检测骨髓单个核细胞VEGF蛋白的表达,PI染色测定白血病细胞的增殖指数。结果:急性白血病细胞VEGF表达量比对照组高(P<0.01),与细胞增殖指数呈正相关(P<0.05)。结论:VEGF在急性白血病的发病过程中可能起重要作用。

抗U1RNP抗体阳性患者血清抗人类肺动脉内皮细胞自身抗体的发现及其意义

目的检测抗U1RNP抗体阳性的自身免疫性疾病患者血清中抗人类肺动脉内皮细胞（HPAEC）自身抗体，并探讨其对肺动脉血管内皮损害的作用机制。方法通过RNA免疫沉降法筛选抗U1RNP抗体阳性血清，免疫印记分析检测血清中抗HPAEC自身抗体。通过流式细胞分析术，确定抗体靶抗原是否位于细胞的表面。用酶联免疫吸附试验（ELISA）测定含有该自身抗体IgG的HPAEC培养上清中活化T细胞调节的正常T细胞表达和分泌的因子（RANTES）的浓度。结果抗U1RNP抗体阳性血清中新发现一种同HPAEC表面相对分子质量31000抗原（HPA31抗原）反应的自身抗体，把含抗HPA31抗体的血清IgG分离纯化后加入HPAEC培养上清中，RANTES的量明显增加。结论自身免疫性疾病患者血清中存在与抗U1RNP抗体有一定相关的抗HPA31抗体，该抗体同细胞表面的靶抗原结合，可以活化HPAEC，促进RANTES产生及分泌，导致肺动脉血管内皮细胞的炎症损害。