p53基因状态对体外微核试验结果影响的研究进展

近年来,体外哺乳动物细胞遗传毒性试验假阳性率高的不足引起了毒理学研究者的关注。体外微核试验常用的啮齿类动物细胞系如CHO,V79,CHL和L5178Y,易产生假阳性结果,可能原因之一是啮齿类动物细胞系的p53基因为突变型,即p53基因功能缺陷。但也有观点认为,p53基因功能不同的细胞系不影响体外微核试验结果的判定。本文主要比较了不同细胞系体外微核试验结果,包括常用的p53基因功能缺陷的啮齿类动物细胞系、p53基因功能完整的细胞系和p53基因功能缺失的NH32细胞。希望有助于阐明遗传毒性化合物引起p53功能不同的细胞系的DNA损伤的机制,合理选择体外微核试验系统,从而降低体外微核试验结果的假阳性率。

人胚胎干细胞在药源性心脏和肝毒性研究中的应用进展

人胚胎干细胞(hESC)具有无限增殖和诱导分化为心肌细胞和肝细胞的能力,可应用于新药筛选和药物的安全性评价过程。心脏毒性和肝毒性是新药研发失败、被监管以及撤市的主要原因。hESC分化的心肌细胞和肝细胞具有结构和功能特性,能在体外模拟药物的心脏和肝毒性,且基于hESC诱导分化的心肌细胞和肝细胞建立的体外新药安全评价系统,具有实验周期短、用药量少、成本低和有效避免种属差异等优点。因此,hESC分化的心肌和肝细胞在药物毒理学研究中具有广阔的应用前景。

斑马鱼胚胎发育毒性模型评价方法的验证

目的：采用已知胚胎毒性药物验证建立的斑马鱼胚胎发育毒性模型。方法采用水浴染毒法，将受精后2～4 h （2～4 hpf）的斑马鱼胚胎暴露于不同浓度梯度的化合物，设置全反式维甲酸阳性照组、胚胎培养液空白对照组及0．1％DMSO 溶剂对照组。分别在24，48，72，144 hpf，观察胚胎的发育情况，记录畸形及死亡的胚胎数目。通过软件得到 EC50，LC50，阳性药物计算致畸指数（TI）＝LC50/EC50，有 TI 药物记为阳性结果；无 TI 则记录为阴性结果。所得结果与动物实验及临床实验结果进行对比，得出灵敏度与特异性。结果胚胎暴露于乙酰氨基酚（TI ＝2．07）、甲硫咪唑（TI ＝2．91）、吲哚美辛（TI ＝1．67）、5-氟尿嘧啶（5-Fu）（TI ＝8．31）、甲氨蝶呤（TI ＝1．31），均呈现不同程度的致畸情况，甲硫咪唑出现较为明显的骨骼畸形；吲哚美辛的毒性主要体现在心脏、血液循环等终点的异常；5-FU 在较低剂量下即产生较高的死亡率，同时还发生较严重的色素缺失；对乙酰氨基酚对心脏、肝等靶器官毒性较大，出现心包囊肿；甲氨蝶呤出现显著的体节、骨骼畸形情况。阳性药物计算得出相应的 TI；而抗坏血酸、异烟肼、青霉素 G、糖精无法计算 TI，为阴性结果。9种化合物的斑马鱼试验结果与传统动物实验及临床表现一致，灵敏度为100％，特异性为100％。结论建立的斑马鱼胚胎发育毒性模型稳定，可应用与药物的早期毒性筛选。

基于人胚胎干细胞的实时细胞系统评价心脏毒性方法的建立

目的采用人胚胎干细胞诱导分化的心肌细胞(human embryonic stem cells derived cardiomyocytes,h ESC-CM)联合实时细胞分析系统(real-time cell analysis Cardio,RTCA Cardio),建立一种体外药物心脏毒性早期筛选方法。方法将h ESC-CM接种到RTCA Cardio E-Plate 96孔板,分析心肌细胞的搏动频率、幅度和搏动节律不规则性指数确定细胞最佳接种密度及检测时间,建立体外药物心脏毒性早期筛选方法。在此基础上,分别采用0.1%DMSO作为溶剂对照及具有抗心律失常作用的药物奎尼丁(0.2、0.78、3.13、12.5、50和100μmol·L-1)作为阳性对照进行了验证。结果0.1%DMSO对h ESC-CM的生长指数(cell index,CI值)、搏动特征图谱及搏动频率和幅度均无影响。而与溶剂对照组相比,奎尼丁浓度≥3.13μmol·L-1时影响细胞CI值和特征性搏动图谱,抑制细胞搏动频率和幅度,且具有浓度依赖性,浓度越高细胞搏动信号恢复所需时间越长,对搏动频率和幅度的抑制作用越明显。结论采用h ESC-CM联合RTCA Cardio系统建立的体外药物心脏毒性早期筛选方法可以检测出奎尼丁对心肌细胞搏动状况的影响,该方法可作为一种高通量筛选工具用于临床前药物心脏毒性早期筛选。

运用实时细胞分析系统监测原代乳鼠心肌细胞的生长及搏动评价抗心律失常药物

目的：建立实时细胞分析系统（ RTCA）心脏毒性研究方法,并应用于药物心脏毒性的早期筛选。方法采用RTCA Cardio系统和新生1～2 d SD大鼠原代培养的心肌细胞建立体外药物心脏毒性早期筛选方法,并用具有抗心律失常药物奎尼丁和利多卡因,通过观察心肌细胞搏动频率、幅度和搏动节律不规则性（ BRl）指数的变化,验证其评价药物的心脏毒性的效果。结果原代心肌细胞接种到 RTCA Cardio E-Plate 96孔板24 h后出现心肌细胞搏动,48 h 后心肌细胞搏动规律且稳定,可持续至少3 d。加入奎尼丁后迅速抑制心肌细胞的搏动,使心肌细胞的搏动频率由155±5降到0,6 h 后抑制作用减弱；低浓度奎尼丁（3.1μmol·L^－1）使心肌细胞搏动恢复到124±16。24 h奎尼丁浓度小于100.0μmol·L^－1时,均能全部恢复细胞搏动。利多卡因加入原代心肌细胞后,心肌细胞的搏动频率、幅度、BRl的变化趋势呈明显的浓度依赖性,浓度越高,对心肌细胞的抑制作用越显著。结论 RTCA Cardio心脏毒性筛选方法可精确地检测出奎尼丁和利多卡因的心脏毒性,提示 RTCA Cardio 心脏毒性筛选方法可用于心脏毒性早期筛选。

大鼠体内多终点实验评价N-亚硝基二乙胺的遗传毒性研究

目的:采用N-亚硝基二乙胺(DEN)作为阳性化合物建立大鼠肝微核实验方法,同时结合彗星实验及外周血微核实验终点于同一个实验中,综合评价其遗传毒性。方法:实验设置阴性对照组(生理盐水)、DEN低(3. 13 mg·kg-1)、中(6. 25 mg·kg-1)、高(12. 5 mg·kg-1)剂量组、Comet阳性对照组(EMS,100mg·kg-1)共5个给药组,每组5只雄性SD大鼠,连续ig给药,在d 14给药后约21 h进行末次给药,在末次给药后约3 h进行外周血采样,进行微核实验,采用流式细胞术测定网织红细胞微核率,并麻醉动物进行彗星和肝微核实验肝脏的取样、处理,最后分别通过Comet Assay软件和荧光显微镜获得结果。结果:肝微核实验中,中、高剂量DEN染毒组肝脏的微核率与阴性对照组相比均显著增加,且呈剂量反应关系(r=0. 98,P <0. 01);彗星实验中,所有DEN染毒组肝脏的尾DNA百分含量与阴性对照组相比均显著增加,且呈剂量反应关系(r=0. 91,P <0. 05);外周血微核实验中,所有DEN染毒组与阴性对照组相比,外周血网织红细胞微核率均没有明显的升高。结论:本实验初步建立了大鼠肝微核重复剂量实验方法,在同一实验中进行肝微核实验、外周血微核实验以及彗星实验多终点的联合检测,不仅可节省实验动物数量,而且可提高实验效率,大大增加遗传毒性实验结果对致癌性的预测性。

生物技术药物的非临床发育免疫毒性研究

随着生物技术药物研发的增加,具有免疫调节功能的生物技术药物在具有生育潜力人群、儿童和青少年相关疾病治疗中的应用也不断增加,使得这类药物的发育免疫毒性(developmental immunotoxici-ty,DIT)越来越受到人们的关注。由于大分子生物技术药物与小分子化学药物本身存在差异,因此传统的DIT评价方法可能需要在种属选择、实验设计等方面加以改进以适应大分子药物的特点。本文将从种属选择、给药时间、给药剂量、检测终点几方面对生物技术药物的非临床DIT研究进行综述。

流式细胞术检测体外微核方法的建立

目的:建立96孔板流式细胞术体外微核自动化检测的方法,并探讨其用于药物早期遗传毒性筛选和遗传毒性评价的可能性。方法:试验分为+S9短时处理组(4 h)和-S9持续处理组(24 h),分别选择3个不同浓度的环磷酰胺和丝裂霉素C处理CHO-K1细胞,24 h后收获细胞。采用EMA和SYTOX Green双色标记,流式细胞仪分析96孔板的微核率,并与常规标准平皿培养、细胞分裂阻滞法的双核微核结果进行比较。结果:在有或无S9处理条件下,不同浓度的环磷酰胺、丝裂霉素C诱导产生的微核率较溶剂对照组均显著增加(P均<0.05),剂量-效应关系明显。两种微核检测方法的Spearman相关系数(r s)为1.000。结论:流式细胞术检测环磷酰胺、丝裂霉素C作用于CHO-K1细胞的微核试验结果均为阳性,与文献报道一致,因而本试验初步建立了流式细胞术体外微核检测方法。流式细胞术检测微核的方法与人工阅片的方法相关性好,提示该方法用于化合物早期遗传毒性筛选和遗传毒性评价具有良好的前景。

斑马鱼饲养管理操作与动物福利

斑马鱼作为一种理想的模式动物广泛的应用于科学试验。近年来，随着对其研究与应用的增加，斑马鱼的使用数量与日俱增。但是对斑马鱼的饲养管理、试验操作和这一系列过程中的动物福利却较少有文献报道，更没有统一的标准。针对此问题，本文综述了相关法规、指导原则及文献，分别对斑马鱼的饲养管理（运输、环境条件、设备维护）、试验操作（繁育、识别标记、麻醉和安死术）和这些过程中的动物福利进行了讨论。旨在为从事斑马鱼相关研究的人员提供参考，保护斑马鱼的福利。

济泰片对人肝及Beagle犬肝中美沙酮代谢活性的影响

目的评价济泰片对人肝中美沙酮代谢活性潜在的抑制作用及对Beagle犬肝中美沙酮代谢活性潜在的诱导作用。方法在人肝微粒体中加入济泰片1.5～150 mg·L-1,CYP3A4抑制剂酮康唑及CYP2D6抑制剂奎尼丁,再加入美沙酮进行共孵育30 min。用美沙酮的代谢产物2-亚乙基-1,5-二甲基-3,3-二苯基吡咯烷(EDDP)的生成速率反映美沙酮的代谢活性,评价济泰片对美沙酮的抑制作用。Beagle犬ig给予济泰片0.1875,0.625和1.875 g·kg-1,每天1次,共36周后制备犬肝微粒体,在制备的犬肝微粒体中加入美沙酮进行共孵育30 min,检测济泰片组美沙酮的代谢产物EDDP的生成速率。结果阳性抑制剂酮康唑、奎尼丁能显著抑制人肝微粒体中的美沙酮代谢,而济泰片未见明显抑制作用。济泰片1.875 g·kg-1组Beagle犬肝微粒体中美沙酮去甲基化反应的反应速率、代谢能力及单位体质量代谢能力均显著高于正常对照组,分别为0.86±0.17 vs(0.49±0.10)cps.min-1.mg-1蛋白,228±62 vs(115±13)cps.min-1.mg-1蛋白,10.6±0.8 vs(24.4±5.6)cps.min-1.mg-1蛋白.g-1(P<0.05)。结论济泰片对人肝中美沙酮的代谢不会产生抑制作用。济泰片对Beagle犬肝中美沙酮代谢具有一定的诱导作用。

应用Bhas 42细胞转化实验检测环磷酰胺、丝裂霉素C和氨苄西林钠致癌作用

目的采用Bhas 42细胞转化实验检测已知有遗传毒性的化学品在化学致癌中的引发和促生长作用,评价Bhas 42细胞转化实验检测化学品致癌作用的可靠性。方法①通过细胞毒性实验确定环磷酰胺、丝裂霉素C和氨苄西林钠进行Bhas 42细胞转化实验的浓度。②引发实验:细胞接种当日为第0天,第1天换成含有相应最终浓度的受试物或0.5%DMSO的DF5F培养基,培养72 h,第4天换成不含药物的DF5F培养基,培养至第21天。第22天将细胞固定、染色、并计数细胞数大于50的集落数。③促生长实验:接种当日为第0天,第4天换成含有相应受试物或0.5%DMSO的DF5F培养基并连续培养至第14天,期间第7天,第11天更换同样培养基,每15天换成不含药物的DF5F培养基,培养至第21天。第22天固定、染色细胞、计数细胞数大于50的集落数。结果按照70%的细胞存活率以及前期文献结果确定最终浓度为:氨苄西林钠1750 mg·L-1;环磷酰胺1300 mg·L-1;丝裂霉素C 0.01 mg·L-1;3-甲基胆蒽1 mg·L-1,佛波酯0.05 mg·L-1。引发实验结果显示,3-甲基胆蒽,丝裂霉素C和环磷酰胺集落数显著多于空白对照、并且两者比值>2,判定为有引发作用的致癌化学品。促生长实验结果显示,佛波酯集落数显著多于空白对照、并且两者比值大于2,因此判定为有促生长作用的致癌化学品。结论 Bhas42细胞转化实验不仅可以检测出遗传实验可检测出的致癌阳性化学品和非致癌化学品,还可检测出遗传实验结果为假阴性的致癌阳性化学品,可以作为一种快速易操作的致癌物预测体外模型。

氯胺酮对HepG2细胞线粒体功能的影响

目的评价氯胺酮的线粒体毒性,从而探讨氯胺酮可能的毒性机制。方法 Hep G2细胞培养基中分别加入齐多夫定10~2000μmol·L-1培养7 d,或加入氯胺酮50~3000μmol·L-1培养24 h,CCK8细胞计数法测定细胞存活率。Hep G2细胞培养基中分别加入齐多夫定100μmol·L-1培养7 d后,或加入氯胺酮100和1200μmol·L-1培养24 h,化学发光法检测胞内ATP合成水平,荧光探针法检测胞内钙离子浓度、活性氧及线粒体膜电位（ΔΨm）的变化,同时设齐多夫定1000μmol·L-1用于实时荧光定量PCR检测线粒体DNA（mt DNA）表达水平的变化。结果与正常对照组相比,齐多夫定10~2000μmol·L-1可以抑制细胞存活,IC50为100μmol·L-1;氯胺酮1000~3000μmol·L-1抑制细胞存活,IC50为1200μmol·L-1。与正常对照组相比,齐多夫定100μmol·L-1组线粒体ATP合成水平显著下降（P〈0.05）,胞内钙离子浓度明显升高（P〈0.05）,活性氧水平显著升高（P〈0.05）,ΔΨm显著下降（P〈0.05）,而1000μmol·L-1可以明显干扰mt DNA表达水平（P〈0.05）。氯胺酮100μmol·L-1组ATP合成水平明显下降（P〈0.05）,其他指标均无显著性差异;氯胺酮1200μmol·L-1组ATP合成水平显著下降（P〈0.01）,活性氧水平和胞内钙离子浓度显著升高（P〈0.01）,ΔΨm显著下降（P〈0.05）,mt DNA水平无明显改变。结论氯胺酮可以通过干扰线粒体代谢功能而诱导线粒体损伤。

斑马鱼胚胎发育毒性评价方法的建立

目的以致胚胎毒性阳性药物全反式维甲酸（ATRA）及丙戊酸钠进行斑马鱼胚胎发育毒性试验，建立有效的斑马鱼胚胎发育毒性评价方法。方法采用水浴染毒法，将受精后2h（2hpf）的斑马鱼胚胎暴露于不同浓度梯度的阳性约物。分别在24、48、72和144hpf观察并记录畸形及死亡的胚胎数目。统计阳性药物的EC50和LG50，计算致畸指数（TI=LC50／EG50）。结果两种阳性药物所致斑马鱼胚胎发育早期（24～48hpf）与发育后期（72～144hpf）的畸形表现不同。在72hpf，两种阳性药物对胚胎孵化率均有明显抑制作甩144hpf可见ATRA（≥1．6×10^-3mg／L）和丙戊酸钠（≥1．25×10^2mg／L）严晕致畸作用，T1分别为10.35和5．72。两种阳性药物胚胎敛畸率及死亡率均呈明显的浓度依赖关系，且与已有动物试验及体外试验结果相符。结论以两种阳性药物建立有效的斑马鱼胚胎发育毒性评价方法，可进行进一步的验证。

单次鼻滴入油酸对SD大鼠的呼吸系统急性损伤作用

将SD大鼠70只随机分为阴性对照组、博来霉素(5 mg/kg)对照组和油酸3个剂量(12、60和120 mg/kg)组,均采用单剂量鼻滴入给药。测定给药后0.5、1、2、4和8 h时动物的呼吸频率、潮气量和每分通气量。给药后d3、d7和d21分批处死动物。取左肺叶进行支气管肺泡灌洗,进行灌洗液(BALF)中炎症细胞总数和分类计数,并测定全蛋白浓度和乳酸脱氢酶(LDH)活性;另取右肺上叶测定羟脯氨酸(HYP)含量,右肺下叶用于组织病理学观察。结果表明,油酸3个剂量组在0.5 h时的呼吸频率均明显高于阴性对照组,而潮气量则明显降低。与阴性对照组相比,油酸高剂量组的BALF中炎症细胞总数、中性粒细胞、嗜酸性粒细胞明显增多,蛋白含量、LDH活性增大,肺组织病理切片可见炎性改变及泡沫细胞产生。油酸3个剂量组中HYP含量与阴性对照组均无显著差异(P>0.05)。提示高剂量油酸可致SD大鼠肺组织急性损伤并影响呼吸功能,但该效应可逆。

(1R,2R)-SIPI5358和SIPI5358对未分化PC12细胞延迟整流钾电流的抑制作用

利用全细胞膜片钳技术研究新化合物(1R,2R)-SIPI5358和SIPI5358对未分化PC12细胞延迟整流钾电流(IK)的影响。结果表明,(1R,2R)-SIPI5358和SIPI5358可抑制未分化PC12细胞的IK,且抑制作用具有浓度和电压依赖性,IC50分别为(0.64±0.17)和(12.05±3.31)mol/L。1 mol/L的(1R,2R)-SIPI5358可使未分化PC12细胞的IK稳态激活曲线和失活曲线向超极化方向移动4和20 mV。20 mol/L的SIPI5358可使未分化PC12细胞的IK稳态激活曲线向去极化方向移动7mV;使失活曲线向超极化方向移动21 mV。(1R,2R)-SIPI5358和SIPI5358对IK的影响可能与其神经毒性有关。

啮齿类动物多器官微核试验的最新进展

遗传毒性评价是化合物安全评价中很重要的一个环节,微核试验是检测潜在遗传毒物常用的试验方法。微核试验可以在多种组织器官上进行,如肝脏、肺、皮肤、结肠、脾脏、睾丸和在经胎盘暴露下的胎儿及新生儿组织。在风险评估和研究系统性遗传毒性及作用方式等方面,用除骨髓以外的组织进行微核试验是很重要的。目前大部分除骨髓和血细胞外的组织器官的微核试验方法尚未标准化,也未经过监管程序的验证,故需要更多的研究和发展来支持监管研究。本研究综述概括了多种器官微核试验的最新发展及前景,望其在化合物遗传毒性评价中的应用提供参考依据。

人胚胎干细胞和诱导型人多能干细胞分化的心肌细胞在药物心脏毒性筛选中的应用

心脏毒性是药物研发失败的主要原因之一,也是临床前安全评价研究的难题之一。人胚胎干细胞和诱导型人多能干细胞均具有无限增殖、自我更新和多向分化的特性,为体外心脏毒性筛选实验提供了细胞资源。人胚胎干细胞和诱导型人多能干细胞诱导分化的心肌细胞相似,具有相同的形态结构,且随着培养时间的推移,功能性K+、Na+、Ca2+通道密度逐渐增加、心肌特异性基因ANF、α-MHC、MLC-2a的表达量增加,具有相似的动作电位时程和收缩性等特点,相当于幼稚型心肌细胞。将它们应用于已知作用药物的心脏毒性筛选,检测心肌细胞离子通道、动作电位、心脏损伤标志物、收缩功能的变化,获得与临床相似的结果。因此,建立人胚胎干细胞和诱导型人多能干细胞诱导分化心肌细胞的体外评价模型,大大减少了药物研发的时间和成本,克服了种属间的差异,推动了心脏毒性体外评价方法的发展。