心肌细胞功能的分子微循环学初步实验研究

目的应用微循环及分子生物学实验方法研究心肌细胞的生理功能 ,观察一氧化氮(NO)对心肌细胞功能的影响 ,试图为防治心血管疾病寻找新的治疗靶点。方法培养新生Wistar大鼠心脏各部位的心肌细胞 ,用TimeLapseRecorder8050缩时录像技术以及微循环图像数字处理技术记录分析培养的心脏各部位心肌细胞功能 ,同步检测正常状态及不同浓度的NO作用下心脏各部位细胞搏动频率、存活率和凋亡细胞的比例。结果通过正常的放像速度观察发现 ,心脏各部位细胞的搏动频率分别为心尖细胞(115.34±11.36)次/min、心房细胞(78.5±11.0)次/min、左心室细胞(88.4±6.3)次/min、右心室细胞(90.3±10.9)次/min ,平均搏动频率为81.3次/min。不同浓度的L -AA对各部位心肌细胞的搏动频率无明显影响。各部位的细胞存活率分别为总细胞生存率96 %、心尖95.3 %、心房96 %、左心室95 %、右心室95 %。不同浓度的L -AA对细胞存活率无影响。流式细胞仪显示细胞的凋亡率分别为全心脏5.1 %、心尖1.8 %、心房1.3 %、左心室1.1 %、右心室4.8 %。不同浓度的L -AA对细胞凋亡率无影响。结论上述实验结果表明 ,不同部位的心肌细胞其搏动频率不同 ,信号起始处的心尖细胞搏动最快 ,信号传递终末处的心房细胞搏动最慢 ,表现出区域差异性。在正常状态下 ,

人循环内皮细胞的分离和鉴定

目的建立从外周血中获取循环内皮细胞（CECs）的免疫磁珠分离技术。方法 取1 mL全血按1： 2稀释；加入20 μL抗CD146磁珠抗体；4℃孵育；再加入等体积缓冲液；置于磁架上；吸弃液体；用100 μL缓冲液重悬磁珠。用吖啶橙或Giemsa染色在荧光倒置相差显微镜下计数与磁珠结合的细胞；并用抗-vWF及CD31进行免疫细胞化学鉴定。结果 经抗-vWF及CD31鉴定所分选的CECs是内皮细胞。正常健康体检者的CECs数量为10.5（6～16.5）个/mL。使用此法对正常人脐静脉内皮细胞（HUVECs）混合于正常人全血中的最高回收率为91%。结论 用CD146免疫磁珠技术分离CECs；具有客观、准确、省时、特异性强及回收率高、取血量少和对内皮细胞损伤小的特点；本方法可用于不同疾病患者血液中CECs的定量检测及其功能状态分析。

PPAR-γ配体与炎症、心肌缺血/再灌注损伤防治的研究进展

Peroxisome proliferation-activated receptor-γ (PPAR-γ) is a ligand-activated transcription factor belonging to the nuclear hormone receptor superfamily and participates in the regulation of various metabolic pathways as well as inflammatory responses. PPAR-γ ligands significantly improve myocardial functional recovery and prevent ischemia-reperfusion induced injury. Given the increasing understanding of the cardioprotective effects of PPAR-γ ligands,we know today that the therapeutic effects of PPAR-γ ligands reach far beyond their use as insulin-sensitizers,as many of these agents exert beneficial effects in the conditions associated with ischemia-reperfusion and inflammation.

红细胞代用品的研究进展

近年来国内外多家研究机构在红细胞代用品的研究上取得了可喜的进展,其中血红蛋白氧载体、全氟碳化合物和血红蛋白微囊三大类有着良好的发展前景,为缓解日益紧张的血源供应和解决输血引起的副作用问题提供了可能。本文对红细胞代用品的结构、性质及临床应用的研究进展作一综述。

红细胞代用品的研究进展

输血来源有限,且输注后可能引起严重的不良反应,因而国内外科学家对以携氧液作为输血替代品进行了长达一个多世纪的探索。迄今为止,几种第一代红细胞代用品已经有望获准上市。各种产品有其独自的生理特性、生物活性和副作用。作者着重综述了基于人,牛和重组来源血红蛋白衍生的红细胞代用品以及携氧氟碳乳剂,描述了多聚血红蛋白(PolyHeme,HBOC-201,Hemolink),双阿司匹林分子内交联血红蛋白(HemAssist),重组人血红蛋白(rHb1.1,rHb2.0),共轭血红蛋白(PHP,MP4),血红蛋白微囊,全合成型白蛋白-血红素载体和氟碳乳剂(Oxygent,Oxyfluor,Perftoran)等红细胞代用品的研制情况,产品特性,生理学效应,实(试)验效能和副作用。作为氧治疗剂进行研发,可能成为今后红细胞代用品研制的发展方向。

急性心肌梗塞患者外周血中循环内皮细胞含量的改变及凋亡的检测

目的应用我所新建立的循环内皮细胞（Ｃｉｒｃｕｌａｔｉｎｇ Ｅｎｄｏｔｈｅｌｉａｌ Ｃｅｌｌｓ，ＣＥＣ）的分离计数方法计数急性心肌梗塞患者外周血中循环内皮细胞含量的改变并检测其凋亡。方法Ｐｅｒｃｏｌｌ密度梯度离心后，将其先后标记以鼠抗人ＣＤ３１抗体，ＦＩＴＣ－羊抗鼠ＩｇＧ及碘化丙啶。应用流式细胞伙计数ＣＤ３１阳性细胞的百分比，并通过检测ＣＥＣ的ＤＮＡ倍体含量检测其凋亡状态。结果急性心肌梗塞组（ｎ＝１６）与正常对照组（ｎ＝１６）的 ＣＥＣ分别为 ６２．９±２４．５／ｍｌ及 ２９． ９±９．１／ｍｌ全血，两者有非常显著性差异（Ｐ<０．０００１）。两组均为双倍体ＤＮＡ，无亚二倍体峰的出现，说明无细胞凋亡的发生。结论此方法克服了以往ＣＥＣ研究方法的缺点，提高了特异性及回收率，使ＣＥＣ真正成为来自活体的特异的且直接反映血管损伤的量化指示物。

以体外共培养系统进行乳腺癌细胞株对正常内皮细胞作用的研究

目的本文建立了体外肿瘤细胞与内皮细胞的共培养体系 ,试图以这种体外共培养环境下了解乳腺癌细胞对正常内皮细胞的作用 ,模拟研究体内肿瘤细胞对血管内皮细胞的细胞性质和行为的作用和影响。方法对乳腺癌细胞株MCF -7、MDA -MB -231与正常、新鲜脐带的静脉内皮细胞体外共培养的细胞比例和培养条件进行了实验摸索 ,分别建立了体外乳腺癌细胞株MCF -7、MDA -MB -231与正常脐带静脉内皮细胞的体外共培养体系。以同期培养的正常脐带静脉内皮细胞为对照 ,对以上述体系共培养后的内皮细胞进行形态学研究 ,基因表达分析和血管新生状况进行缩时观察。本文所用的内皮细胞均以CD31免疫磁珠进行分选 ,并进行形态学和免疫组化鉴定。结果所建立的细胞共培养体系条件能够使乳腺癌细胞株MCF-7、MDA -MB -231与内皮细胞同步生长 ,并细胞比例和培养时间分别在1∶2、72h和1∶3、96h时达到最佳。经共培养后的内皮细胞形态和超微结构均与同期培养的正常内皮细胞对照比较表现明显不同 ,其细胞形态有明显的不规则的变形和呈游走状。超微形态呈 (1)细胞核膨大、核胞比例增大、核仁增大 ,(2)细胞质内质网疏松、变形 ,(3)细胞表面纤毛减少 ,(4)细胞表面窗孔加深 ,(5)细胞间隙增大 ;与血管新生相关的基因ESM、IGFBP -3、ανβ3、

小G蛋白与心肌肥厚的研究进展

小分子量鸟苷酸结合蛋白 (小G蛋白 )家族包括五个家族成员 ,作为分子开关调控着许多细胞反应过程。体内体外实验证实其介导的信号转导通路能诱发心肌细胞肥厚基因的表达及细胞骨架重排 ,在心肌肥厚和心力衰竭的发生发展中发挥重要的调控功能。了解其信号转导通路 ,可为治疗心肌肥厚、防治心力衰竭提供新的药物靶点。

光学蛋白质芯片检测乳腺癌胸苷磷酸化酶的初步研究

目的应用我国自行研制的无标记光学蛋白质芯片检测乳腺癌组织中的胸苷磷酸化酶(Thymidine phosphorylase,TP),为建立一种快速、简便的临床检测方法进行初步探索。方法将 TP 的多克隆抗体固定于已经过表面改性的固相光学抛光硅片表面上制备无标记光学蛋白质芯片,通过椭偏光学显微成像技术检测20例经病理证实的乳腺浸润性导管癌组织标本和正常组织标本中 TP 水平,以芯片灰度值表示组织中 TP 浓度高低。同时应用 ELISA 方法测定,并比较两种方法检测结果的一致性。结果 20例癌组织的灰度值35.40±11.55,20例正常组织的灰度值为26.80±8.78,两组间差异具显著性意义(P<0.05)。以44.36(正常组织平均值+2倍标准差)为阈值,乳腺癌检测的灵敏度为20.00%,特异度为100.00%。同 ELISA 检测结果相比,在20例乳腺癌组织标本检测中,两种方法的一致性具极显著意义(P<0.01)。结论我国首创的椭偏光学显微成像技术简单、直观,结合光学蛋白质芯片可用于胸苷磷酸化酶的临床检测。

白血病间充质细胞体外转分化内皮细胞的研究

目的实体肿瘤抑或血液系肿瘤的生长和转移都是血管依赖性的 ,在血管新生过程中 ,内皮细胞的分化来源是其中的重要研究课题。已证实正常组织中的间充质细胞具有多分化潜能。为进一步探讨肿瘤血管新生的机制、肿瘤组织中内皮细胞的分化来源及其增殖机制 ,本文以初治白血病骨髓标本为研究对象 ,进行肿瘤状态下的骨髓间充质细胞转分化内皮细胞的研究。方法采集初治白血病骨髓标本 ,以淋巴细胞分离液1800r/min离心 ,分离出单个核细胞 ,以HumanMesenchymalStemCells基础及补充培养基进行骨髓中间充质细胞的扩增培养 ,以上述培养基培养14d以上 ,后分选出间充质细胞转入含内皮细胞特异性生长因子的内皮细胞培养体系中进行培养。待培养瓶内长满细胞后 ,进行内皮细胞特性鉴定。结果经扩增培养后的骨髓间充质细胞转入至内皮细胞培养系统中 ,再经7～14d培养后 ,收集细胞进行鉴定 ,结果显示在普通光镜下上述细胞形态学符合内皮细胞形态特征 ,收集上述细胞进行内皮细胞特异性Ⅷ因子相关抗原的检测为阳性。结论虽然在骨髓中的间充质细胞所占比例较低 ,但经间充质细胞扩增培养基培养后 ,能够得到较多的间充质细胞用于作进一步的实验研究。本研究的上述初步结果表明在肿瘤时 。

应用缩时录像和图像处理技术研究内皮细胞有丝分裂特征

研究人脐静脉内皮细胞(HUVEC)和大鼠脑微血管内皮细胞(RCEC)的有丝分裂过程及其运动特征。方法用TimeLapseRecorder8050缩时录像机将人脐静脉内皮细胞及大鼠脑微血管内皮细胞活动的状态进行昼夜36h连续记录 ,然后以正常速度回放磁带 ,经MCIP图像处理系统进行图像分析 ,使细胞的有丝分裂过程在加速24倍的短时间内得到更加清晰的动态再现。结果在细胞分裂间期 ,HUVEC处于动态变化过程中 ,细胞膜以“波浪式”不停地运动 ,并不断地向四周伸出扇形伪足。而RCEC则是显现“阿米巴”样的运动并以泡状伪足向四周不断延伸。HUVEC整个有丝分裂过程所需时间为(31.5±4.4)min(n=15),而RCEC有丝分裂全过程则需(29.7±3.0)min(n=12)。结论HUVEC和RCEC有丝分裂过程所需时间没有明显区别 ,但两种细胞的运动特征却不相同 。

肿瘤蛋白质组学研究现状

随着人类基因组计划的基本完成 ,分子医学的研究领域转移到蛋白质组学研究。在后基因组时代 ,蛋白质组学对发现肿瘤诊断标志物及可能的新型治疗靶分子提供了可能 ,血清蛋白质组诊断模式的发展更为其临床应用提供了条件。现主要对肿瘤蛋白质组学研究内容。

结缔组织生长因子在血管新生中作用的研究进展

结缔组织生长因子(CTGF)是CCN家族的成员,可以促进内皮细胞生长、迁移、粘附和存活,在调控内皮细胞功能和促进血管新生中具有重要作用。CTGF可促进其他血管新生分子(如bFGF、VEGF)以及与细胞外基质完整性和稳定性相关分子(如胶原、MMPs、TIMPs)的表达或活性,通过直接或间接作用机制在多个环节上调控血管新生,并有望成为抗肿瘤血管新生的新靶向因子。

蛋白质芯片的制备技术研究

蛋白质水平的研究是揭示生命现象本质的关键,新近发展起来的蛋白质芯片技术为进行蛋白质的研究、检测提供了新的手段,本文综述了目前建立起来的包括蛋白质阵列芯片、构象型蛋白芯片、SELDI技术蛋白芯片和光学蛋白芯片等几种蛋白质芯片的制备技术研究,以及原理、特点和用途。

冠心病患者循环内皮细胞与炎性相关因子的研究

目的应用免疫磁珠分离急性心肌梗死(AMI)及不稳定性心绞痛(UA)患者外周血中循环内皮细胞(CECs),探讨与炎性相关因子C反应蛋白质(CRP)、白细胞介素-6(IL-6)及肿瘤坏死因子α(TNFα)的相关性.方法 AMI及UA患者入院时取静脉血,用携带抗CD146抗体的免疫磁珠分离外周血CECs;遗传性血友病因子(vWF)、CD31免疫组化及透射电镜对分选细胞进行鉴定;应用Annexin V-FITC/PI检测其凋亡状态;酶联免疫法检测各种炎性相关因子.结果 AMI组(n=37)及UA组(n=12)的CECs数量[中位数(四分位数间距)分别为52(28～81.5)个/ml,29(18～61)个/ml]和血清CRP水平显著高于正常对照组(n=42,P<0.001).AMI加UA组剔除合并糖尿病的患者后(n=26),CECs数量与CRP水平仍显著高于对照组(P<0.001);AMI及UA组CECs的坏死率显著高于对照组(P<0.01);分选出的细胞vWF因子、CD31表达阳性;以研究对象作为整体分析时,CECs数量与CRP及IL-6水平呈显著相关(r=0.677, 0.316,P=0.000, 0.002),多元线性回归分析显示CRP水平及糖尿病对CECs数量有显著影响(OR=0.620, 0.164, 95%CI:3.985～6.751, 0.301～21.877, P=0.000, 0.044).结论 AMI及UA患者CECs数量增加与炎症引起的血管内皮损伤有关.

pcDNA3-HIF-1α真核表达质粒的构建及其在MCF-7细胞中的表达

目的构建低氧诱导因子1α(H IF-1α)真核表达质粒,并在MCF-7细胞中进行功能验证。方法利用RT-PCR扩增带有XbaⅠ和H indⅢ酶切位点的H IF-1α编码基因,插入T载体测序正确后,克隆入pcDNA3真核表达载体,然后将其转染MCF-7细胞。W estern b lot和双荧光素酶报告基因法分别检测H IF-1α表达及其DNA结合活性;实时定量PCR检测H IF-1α对低氧诱导基因C-METmRNA表达的影响;Caspase3/7活性检测来初步判断H IF-1α对低氧MCF-7细胞凋亡的影响。结果酶切及测序结果证明pcDNA3-H IF-1α表达质粒的DNA序列完全正确。将此质粒转染MCF-7细胞后,H IF-1α蛋白表达明显增加,它不仅增强了pGL3-EPO-HRE报告基因活性而且促进了C-METmRNA的表达,同时还降低了低氧MCF-7细胞中Caspase3/7的水平。结论pcDNA3-H IF-1α真核表达质粒构建成功,它不但具有很强的DNA结合和诱导活性,而且在细胞低氧过程中具有一定的抗凋亡作用。

pGL3-EPO-HRE报告基因质粒的构建及功能鉴定

目的构建串联低氧反应元件(HRE)报告质粒pGL3-EPO-HRE并进行功能验证。方法按照人促红细胞生成素(EPO)基因3′末端HRE增强子序列,人工设计合成首尾2段3′末端部分互补的单链DNA,然后通过退火及延伸合成两端带有M luⅠ和BglⅡ酶切位点的包含3个串联排布的HRE的双链DNA,克隆到T载体测序正确后,将其插入到pGL3-promoter报告载体。构建好的pGL3-EPO-HRE分别与pcDNA3-H IF-1α和pcDNA3共转染MCF-7细胞,经氯化钴(CoC l2)作用24h后测定报告基因的活性。结果质粒测序及酶切结果正确,瞬时转染实验显示,在常氧条件下,CoC l2及pcDNA3-H IF-1α可以使pGL3-EPO-HRE报告基因的活性增高约10倍(P<0.01),而且两者共同作用可以使报告基因的活性进一步增高约30倍(P<0.01)。结论pGL3-EPO-HRE可以与低氧诱导因子-1(H IF-1)结合并被激活,可以用来鉴定和检测细胞中H IF-1的表达及蛋白活性。