转基因JAK3体外长期扩增T淋巴祖细胞的实验研究

目的探讨激活JAK3信号传导通路是否能够体外长期扩增调控T淋巴祖细胞并评价其定向分化潜能的可行性。方法构建含有JAK3基因的逆转录病毒载体MG I-F2JAK3,内含有绿色荧光蛋白(GFP)和两个可以结合小分子二聚化合物AP20187的结合位点F36v。将该载体转入小鼠的骨髓造血干细胞中,在无血清培养基X-V ivo15培养体系中扩增,分为4组:空白对照组;AP20187组;干细胞因子(SCF)组;AP20187+SCF组。对扩增的细胞进行流式细胞仪检测免疫分型,定向分化、胸腺内注射等研究。结果AP20187+SCF组可以使转导的造血细胞获得长期大量对数级的扩增,扩增50 d后细胞可以达到1.2×1012倍±0.2×1012倍,所扩增的细胞为最早期的T淋巴祖细胞,表型为C-k ith iCD44+CD25-TN。该祖细胞群在SCF+IL-7+IL-3培养条件下,可定向分化为Thy1.2阳性的T淋巴细胞,并在小鼠的胸腺内可定向分化为GFP+CD3+和GFP+CD4+双阳性的成熟T淋巴细胞。结论AP20187联合SCF激活JAK3信号,可以大量扩增最早期的T淋巴祖细胞。该祖细胞具有定向分化为成熟T淋巴细胞的功能。该系统有助于研究T淋巴细胞的发生发育。

靶基因调控的脐血干/祖细胞体外长期扩增与调控的实验研究

目的探讨转基因JAK2介导的脐血干祖细胞长期扩增调控的可行性和安全性。方法构建逆转录病毒载体MGI-F2JAK2,内含有JAK2基因的功能催化区和两个与小分子靶向基因合成药物(AP20187)结合的位点蛋白(2xF36v,F2)组成。AP20187可与F36v特异结合引起JAK2二聚化而激活细胞内信号传导。该载体同时含有绿色荧光蛋白(GFP)报告基因,用作检测细胞增殖的标记。应用MiniMACS免疫磁珠分选系统纯化分离脐血CD34+细胞,用含JAK2的逆转录病毒上清转染脐血CD34+细胞。转导后的CD34+细胞在SCF、FL、TPO、IL-6细胞因子的联合培养条件下,以不加或加入AP20187分别作为对照组和实验组。定期检测CD34+细胞基因转移后GFP动态变化、细胞免疫标记、造血祖细胞集落培养和裸鼠致瘤试验。结果分选的CD34+细胞纯度为91%以上,基因转移率为49．3%±6．2%；实验组AP20187+SCF+FL+TPO+IL-6(ASFTI)与对照组SCF+FL+TPO+IL-6(SFTI)组均可获得CD34+细胞大量扩增。随着培养时间的延长,实验组扩增的CD34+细胞GFP阳性率由基线水平逐渐上升于第11周时达到95%以上,而对照组GFP阳性率逐渐下降到基线水平以下并逐渐消失。在培养6周左右,实验组CD34+CD38-、CD34+CD38+细胞亚群扩增倍数分别为(228．26±32．31)、(321．48±40．52),分别与对照组相比,差异有显著性。ASFTI组转基因CD34+细胞于12周后仍可产生造血祖细胞集落(BFU-E、CFU-GM、CFU-Mix)。扩增后CD34+细胞检测染色体核型正常,裸鼠实验无致瘤特性。结论转染JAK2基因的人脐血CD34+细胞协同其他细胞因子可以体外长期扩增脐血干祖细胞,对今后开展干细胞治疗某些遗传性血液病有潜在的应用价值。