干细胞移植治疗心血管系统疾病在体示踪影像学研究进展

干细胞移植治疗心血管疾病在动物实验和临床实验中均有很大的进展,采用有效的无创伤性技术监测和追踪干细胞移植治疗的效果,并对移植体内的细胞分布、迁移进行动态的在体观察,对干细胞移植在动物实验研究和临床应用方面起到了促进作用。近年来,用来示踪心血管系统疾病中干细胞移植的各种显像技术和造影剂也有了长足的发展。现对光学成像、放射性核素标记干细胞显像及铁纳米颗粒标记干细胞显像等在体示踪技术进行综述。

单宁酸后处理牛颈静脉血管的血液相容性研究

评价经单宁酸后处理的牛颈静脉带瓣血管的血液相容性,探讨其在心血管外科中的应用前景。带瓣牛颈静脉经常规戊二醛处理后,再以单宁酸溶液进行后处理,然后进行体外动态凝血实验,血小板黏附性能实验,D-二聚体测定和补体激活实验进行血液相容性评价,与传统的戊二醛处理的带瓣牛颈静脉作平行对照。结果表明:(1)单宁酸处理后的带瓣牛颈静脉抗凝血性能优于对照组;(2)单宁酸处理后带瓣牛颈静脉血小板黏附比对照组明显减轻且变形小;(3)D-二聚体含量各组均在正常范围内,单宁酸处理前后无显著性差异(P>0.05);(4)补体激活实验中单宁酸处理后的带瓣牛颈静脉组补体C3a水平明显低于对照组(P<0.05)。经单宁酸处理后带瓣牛静脉体外血液相容性得到改善,显示了在临床上应用的可能性。

酒精对戊二醛固定牛心包影响的实验研究

目的探讨酒精处理对戊二醛固定牛心包体内钙化和力学性能的影响。方法牛心包经戊二醛固定后,再用酒精处理,未经酒精处理组作为对照组。将两组牛心包埋植于大鼠皮下,分别于3周和2个月后取出,然后通过原子吸收光谱法和VonKossa钙染色评估两组牛心包钙含量变化。进行力学性能测试和热皱缩温度测定评估两组牛心包的物理性能。结果组织学检查显示酒精再处理对牛心包胶原纤维结构无明显破坏;大鼠皮下埋植实验显示酒精再处理能显著抑制戊二醛固定牛心包的钙化,3周时酒精再处理的戊二醛固定牛心包组钙含量是(1.08±0.30)mg/g,酒精未处理组钙含量是(24.55±7.16)mg/g;2个月时酒精再处理戊二醛固定牛心包组钙含量是(1.20±0.43)mg/g,酒精未处理组钙含量是(120.22±37.36)mg/g,差异有统计学意义;酒精再处理后牛心包的断裂伸长率增大,抗拉负荷增大,但抗拉强度改变无统计学意义;酒精再处理后牛心包的热皱缩温度下降。结论酒精处理戊二醛固定的牛心包动物体内实验显示有显著的抗钙化作用,并且具有良好的力学性能。

经冠状动脉内移植骨髓间充质干细胞在体示踪及体内再分布的实验研究

目的探讨利用心脏磁共振成像(MRI)对经冠状动脉内注射的超顺磁性氧化铁颗粒(SPIO)标记的骨髓间充质干细胞(bone marrow mesenchymal stem cells,BMMSCs)进行在体示踪的可行性,观察移植细胞在体内的再分布情况。方法从猪的髂骨处抽取骨髓,分离、培养BMMSCs。用SPIO和CM-DiI(Cell TrackerTMC-7001,Molecular Probe)对细胞进行双重标记。通过导管将标记的细胞注射到冠状动脉左前降支内,分别在细胞移植后当天、移植后1周、3周通过MRI检查对移植细胞进行在体示踪;并分别取不同器官的组织标本进行组织病理学检查。结果冠状动脉内注射的SPIO标记的BMMSCs可在心脏MRI上显影,表现为散在分布的点状信号缺失或低密度影像,并可持续3周。病理检查发现移植细胞较为均匀的分布在移植冠状动脉相关的心肌组织内,在移植后1周可见细胞进入冠状静脉系统内。移植细胞在体内能分布至肺、脾和肾,而在肝组织中很少见。结论用MRI技术可对经冠状动脉内注射的SPIO标记的BMMSCs进行在体示踪;移植细胞在体内有向非靶器官再分布的情况,相关器官组织形态学未见明显的改变。

雪旺细胞促进骨髓间充质干细胞增殖的实验研究

目的通过雪旺细胞(Schwann cell,SC)与骨髓间充质干细胞(marrow mesenchymal stem cells,MSCs)复合培养,观察SC对MSCs增殖的影响,为其在构建组织工程血管中应用提供实验依据。方法选用体重40gSD大鼠,用组织块培养法获取SC,用骨髓差速贴壁法获取MSCs;用免疫组织化学法分别对两种细胞进行鉴定。用Transwell培养板复合培养两种细胞,实验组于板上层接种MSCs,下层接种SC;同时上下两层均接种MSCs设为对照组。各组均选择第1、3、5和7天4个时间点进行检测,用氚标胸腺嘧啶核苷酸标记MSCs,液体闪烁仪进行细胞计数(counts per minute,CPM)。提取实验组SC、MSCs和对照组MSCs的细胞蛋白,分别对血管内皮细胞生长因子(vascular endothelial growth factor,VEGF)和其受体Flk-1,协同受体1(neuropilin-1,NRP-1)进行Westernblot检测。结果SC呈梭形,表达S-100蛋白,阳性率达90%。MSCs表达CD105和CD44,不表达CD34和CD45。Transwell复合培养:MSCs,第1、3、5和7天增殖数量分别为2411.00±270.84、3016.17±241.57、6570.83±2848.27、6375.83±1431.28,明显大于对照组2142.17±531.63、2603.33±389.64、2707.50±528.55、2389.00±908.01,差异有统计学意义(P<0.05),实验组CPM值于第5天最高。于复合培养第5天Westernblot显示:SC表达VEGF、Flk-1和NRP-1;VEGF、Flk-1、NRP-1在实验组MSCs中表达明显强于对照组。结论两种细胞体外复合培养后,SC在第1、3、5和7天均能显著增加MSCs的数量,并促进增殖,增殖高峰在第5天。与SC复合培养后,MSCs表达VEGF明显增加,其相应受体Flk-1、NRP-1表达上调,SC通过促进MSCs分泌VEGF增加参与了细胞的增殖过程。

骨髓间充质干细胞经静脉移植到心肌梗死大鼠体内后的分布

目的探讨经静脉注射骨髓间充质干细胞(MSCs)于心肌梗死大鼠模型后在体内的分布及对心功能的影响。方法心肌梗死后1周将标记的MSCs注射到大鼠舌下静脉内,在细胞移植后不同时间点取心、肝、脾、肺、肾脏器,进行组织学检查观察移植细胞的分布。通过心脏超声复查移植后3周、6周心功能改变情况。结果MSCs经静脉注射后各脏器的组织结构无明显异常改变。移植细胞在早期主要分布在正常心肌组织内,1周后主要分布在梗死及交界区内,正常心肌组织内很少见细胞存留。细胞移植后3周、6周实验组左心室没有进一步扩大,心功能没有进一步恶化。结论静脉注射移植MSCs后细胞可以分布到重要组织器官内,并不影响其组织结构;移植细胞有向梗死心肌组织内迁移的趋势,能明显延缓左心室重构而导致的心功能恶化。

静脉移植骨髓间充质干细胞治疗心肌梗塞的可行性研究

目的:探讨经静脉注射骨髓间充质干细胞(MSCs)对心肌梗塞大鼠模型心功能的影响及其在体内的分布情况。方法:在心肌梗塞后1周将标记的MSCs注射到大鼠舌下静脉内,在细胞移植后不同时间点取心、肝、脾、肺、肾脏器,进行组织学检查,观察移植细胞的分布。选取心肌梗塞模型大鼠通过心脏超声评价移植后3周、6周心功能改变情况。结果:静脉注射MSCs后其组织结构未发现明显异常改变,早期主要分布在正常心肌组织内,1周后主要分布在梗塞及交界区内,正常心肌组织内很少见细胞存留。超声检查发现在细胞移植后实验组(12只)左心室没有进一步扩大,左心功能明显好于对照组(12只):[左心室收缩末期内径(0.92±0.16)∶(1.078±0.15)cm;左心室舒张末期内径(0.66±0.13)∶(0.79±0.11)cm;左心室短轴缩短率(28.4±4.2)∶(24.3±3.1)%;左室射血分数(52.7±4)∶(42.89±4.2)%,P均<0.05]。结论:静脉注射移植MSCs后细胞可以分布到重要组织器官内,移植细胞有向梗塞心肌组织内迁移的趋势,能明显延缓左心室重构及其所导致的心功能恶化。

心脏MRI在体示踪移植细胞的可行性研究

目的:寻找一种能够对移植细胞进行在体示踪的标记方法,为细胞移植的动物和临床实验中细胞的存留、迁移提供重要手段。方法:从中华小型猪髂骨处抽取骨髓,体外培养扩增MSCs。将SPIO和MSCs共同孵育培养36h。普鲁士蓝染色评价细胞的标记效率;通过MTT比色实验评价SPIO对细胞生长能力的影响;台盼蓝染色检验标记后细胞的活性;使用CostarTranswell方法评价铁离子对细胞迁移能力的影响;用细胞分化诱导液培养标记后的细胞评价其向成脂肪细胞和成骨细胞的分化能力。在体内实验中将SPIO标记或未标记的自体MSCs注射到心肌或冠状动脉内,通过心脏磁共振检查对移植细胞进行在体示踪观察。在细胞移植后不同时期取材动物心脏切片进行普鲁士蓝染色观察移植细胞。结果:MSCs经铁离子标记后普鲁士蓝染色阳性率在98%以上,可见蓝染颗粒位于细胞浆内,标记细胞电镜切片观察可见高密度铁颗粒位于细胞浆内。MTT比色实验发现随着培养液中SPIO浓度的增加细胞增殖能力没有明显改变;台盼蓝染色显示标记后98%的细胞保持活性;细胞经SPIO标记后仍可保持原有的细胞形态,可继续培养、传代。细胞迁移试验发现细胞标记后对SDF-1和VEGF诱导的迁移能力没有明显的减低。铁离子标记后细胞仍可向成脂肪细胞和成骨细胞分化。注射到心肌或冠状动脉内的SPIO标记的MSCs可通过心脏磁共振检查进行在体示踪,动态观察显示SPIO标记细胞在磁共振影像上表现为低密度灶影或信号缺失,并且在移植后4周仍可显影。病理学检查可以看到移植细胞呈普鲁士蓝染色阳性,并和影像学有很好的一致性。结论:临床使用的SPIO磁共振对比剂可以安全、有效的标记MSCs。利用心脏磁共振对移植的标记细胞可以实现移植细胞的在体示踪观察。此标记方法结合心脏磁共振技术为移植细胞的在体示踪和细胞存留、迁移的研究提供了良好的手段。

心肌梗死后基质细胞衍生因子-1的表达及其意义

目的探讨大鼠心肌梗死(MI)后不同时间,梗死组织基质细胞衍生因子-1(SDF-1)的表达以及与骨髓间充质干细胞(MSC)迁移的关系,为细胞移植提供可靠依据。方法在MI后不同时间,用PCR测定梗死组织中SDF-1表达的水平。提取梗死心肌组织提取液,在Costar Transwell双层细胞培养皿观察MI后不同时间梗死心肌组织对MSC迁移能力的影响。结果SDF-1在组织脏器内的表达存在差异,MI梗死心肌组织中SDF-1的表达呈现出时间变化的趋势,梗死后48h达到高峰水平。梗死后的心肌组织对MSC迁移的影响与SDF-1的表达呈相同的变化程序,梗死后48h对MSC的趋化作用最强。经SDF-1的受体CXCR4特异性阻滞剂处理后,MSC向梗死组织提取液迁移的能力受到明显抑制。结论MI后的早期,局部组织中SDF-1的表达明显升高,并可在MI后2周内维持在一个相对高的水平,其对于移植细胞向梗死区域迁移具有重要的作用。

超顺磁性氧化铁作为细胞标记试剂的可行性研究

目的:评价目前临床使用的磁共振对比增强剂超顺磁性氧化铁颗粒(SPIO)进行骨髓间充质干细胞(MSCs)标记的安全性、有效性。方法:从中华小型猪髂骨处抽取骨髓,体外培养扩增MSCs。将SPIO和MSCs共同孵育培养36h。普鲁士蓝染色评价细胞的标记效率;通过MTT比色实验评价SPIO对细胞生长能力的影响;台盼蓝染色检测标记后细胞的活性;使用Costar Transwell方法评价铁离子对细胞迁移能力的影响;用细胞分化诱导液培养标记后的细胞评价其向成脂肪细胞和成骨细胞的分化能力。结果:①MSCs经SPIO标记后普鲁士蓝染色阳性率在95%以上,电镜切片观察可见高密度铁颗粒位于细胞浆内。②MSCs经SPIO标记后,MTT比色实验发现随着培养液中SPIO浓度的增加细胞增殖能力没有明显改变;台盼蓝染色显示98%的细胞保持活性;仍可保持原有的细胞形态,可继续培养、传代;细胞迁移试验发现MSCs对SDF-1和VEGF诱导的迁移能力没有明显的减弱;细胞仍可向成脂肪细胞和成骨细胞分化。结论:SPIO可以安全、有效地标记MSCs。

心脏磁共振在体示踪移植细胞的可行性研究

目的:寻找一种能够对移植细胞进行在体示踪的标记方法,为移植细胞存留、迁移提供重要观察手段。方法:从中华小型猪髂骨处抽取骨髓,体外培养扩增骨髓间充质干细胞(MSCs)。将SPIO和MSCs共同孵育培养36h。普鲁士蓝染色评价细胞的标记效率;通过MTT比色实验评价SPIO对细胞生长能力的影响;台盼蓝染色检验标记后细胞的活性;使用Costar Transwell方法评价铁离子对细胞迁移能力的影响;用细胞分化诱导液培养标记后的细胞评价其向成脂肪细胞和成骨细胞的分化能力。在体内实验中将SPIO标记或未标记的自体MSCs注射到心肌内,通过心脏磁共振检查对移植细胞进行在体示踪观察,取材动物心脏行病理检查观察移植细胞的存活、存留。结果:MSCs经铁离子标记后普鲁士蓝染色阳性率在98%以上,可见蓝色颗粒位于细胞浆内,标记细胞电镜切片可见高密度铁颗粒位于细胞浆内。随着培养液中SPIO浓度的增加细胞增殖能力没有明显改变;标记后98%的细胞保持活性;SPIO标记后的细胞保持原有的形态,可继续培养、传代;SDF-1和VEGF诱导的迁移实验发现标记细胞迁移能力没有降低;铁离子标记后细胞仍可向成脂肪细胞和成骨细胞分化。注射到心肌内的SPIO标记的MSCs可通过心脏磁共振检查进行在体示踪,动态观察显示SPIO标记细胞在磁共振图像上表现为低信号,并且在移植后4周仍可成像。病理学检查可以看到移植细胞呈普鲁士蓝染色阳性,并和影像学有很好的一致性。结论:临床使用的SPIO磁共振对比剂可以安全、有效地标记MSCs,心脏磁共振检查可以实现SPIO标记的移植细胞的在体示踪。

阳离子脂法介导质粒转染大鼠骨髓基质干细胞用于基因修饰的细胞移植治疗

目的探讨阳离子脂转染方法在骨髓基质干细胞(BMSC)基因转染中的应用。方法通过梯度试验确定相对最佳的转染条件并测定LipofectamineTM2000(LP2000)介导增强型绿色荧光蛋白(EGFP)基因转染大鼠BMSC的瞬时转染效率;分析细胞周期对导入基因表达的影响;以流式细胞仪测定转基因BMSC的EGFP表达强度和阳性比例随时间的变化;将EGFP基因转染的大鼠BMSC注射法移植入同源大鼠心肌内,以逆转录PCR法检测心肌组织内EGFP基因的转录,荧光显微镜法检测EGFP阳性的BMSC。结果在不同转染条件下(DNA浓度、DNA:LP2000),LP2000介导EGFP基因转染大鼠BMSC的瞬时转染效率不同;通过阳离子脂法导入基因的表达效果受细胞周期制约;细胞移植后,能在大鼠心肌组织中检测到EGFP基因的转录以及表达EGFP基因的BMSC。结论阳离子脂可以作为基因修饰的细胞移植治疗的有效载体。为了提高基因转染的瞬时效率和基因的表达效率,降低毒性、满足转基因细胞移植的要求,尚需进一步的研究。

降低医用牛心包致热原性研究

目的比较不同浓度酒精溶液洗脱医用牛心包中残留戊二醛的效果,通过酒精溶液洗脱作用降低其致热反应。方法牛心包经戊二醛固定后,再用酒精溶液处理,未经酒精溶液处理组作为对照组。分别采用50%、60%、70%、80%、90%酒精溶液对医用牛心包进行浸泡洗脱处理,应用气相色谱法测定洗脱液中戊二醛的浓度,比较不同浓度酒精溶液洗脱戊二醛效果;并采用2005年版《中华人民共和国药典》附录热原检查的方法,检测经60%、70%、90%不同浓度酒精溶液洗脱后牛心包致家兔体温升高的差别。结果洗脱实验中,60%和70%酒精溶液对医用牛心包冲洗后,洗脱液中戊二醛含量分别达18.21‰±0.14‰和11.91‰±0.09‰,优于其余浓度组(n=3,P<0.01),60%酒精溶液组优于70%酒精溶液组(n=3,P<0.05);热原实验,60%、70%、90%酒精溶液处理组、戊二醛对照组家兔体温升高值分别为0.5℃、0.6℃、0.9℃、0.8℃,其中以60%的酒精溶液效果最优,与对照组相比差异有统计学意义(n=3,P<0.05),其余两组与对照组比较差异无统计学意义。结论60%酒精溶液处理可以有效洗脱医用牛心包中残留戊二醛,并且可明显降低其致热原性。

乳鼠心肌细胞联合人工基质移植改善大鼠心肌梗死后心功能的实验研究

目的探讨体外构建液态组织工程学心肌(engineering heart tissue,EHT)的方法,以及其移植于大鼠心肌梗死区域后是否能存活并改善心脏功能。方法结扎雌性Sprague-Dawley(SD)大鼠左冠状动脉,制作心肌梗死模型。分离、标记及培养新生1～3天SD乳鼠心肌细胞。心肌梗死后合格的动物模型随机分成EHT组(n=12)、单纯心肌细胞组(n=12)、单纯基质组(n=12)、对照组(n=11)。移植术后4周,用超声心动图及离体心脏灌流2种手段评价心功能,标本取材做病理学检查及Y染色体多聚酶链检测(polymerase chain reaction,PCR)。结果PCR检测证实EHT组和单纯细胞组移植细胞存活,但病理学检查表明EHT组的移植细胞排列更紧密,细胞间有连接蛋白形成。超声心动图显示EHT组的左室缩短分数最高(22.82±3.44)%,高于细胞组(20.55±4.11)%、人工基质组(17.05±4.57)%和对照组(19.80±3.98)%,P=0.012。心脏灌流模型提示在左心室球囊容积为0.06、0.08、0.10ml时,左心室发展压及dp/dt差异有统计学意义,EHT组最佳(P<0.05)。结论体外成功构建液态EHT后,可以通过注射方法移植于大鼠心肌梗死区域。液态EHT移植后较单纯细胞移植组织形态更佳、更能改善梗死心脏的功能。