不同代次人胎盘间充质干细胞的生物活性比较研究

目的旨在观察不同代次人胎盘间充质干细胞(PMSCs)体外培养的生物学特性和体外诱导分化潜能,为间充质干细胞临床应用安全性及有效性提供实验依据。方法无菌条件下获取人足月胎儿胎盘组织,通过II型胶原酶消化法分离PMSCs,在常规培养条件下培养至第9代,倒置相差显微镜观察P0、P3、P6、P9代次的间充质干细胞细胞形态;MTT活细胞计数法检测细胞生长增殖能力;流式细胞术分析细胞周期及表面标志物的阳性表达率。同时进行成脂、成骨、成软骨诱导分化,诱导14 d后分别进行油红O染色、茜素红S染色、Masson染色鉴定,观察并比较不同代次PMSCs的多向诱导分化能力。结果 PMSCs具有很强的贴壁能力,主要呈纺锤梭形,不同代次的PMSCs有不同的体外增殖能力,以P0、P3代较强;均高表达CD73、CD90、CD105,低表达CD14、CD34、CD45和CD20。细胞周期中G0/G1期细胞所占比例P0为90.95%、P3为88.97%、P6为85.93%、P9为67.89%,诱导分化实验显示,P6、P9代细胞多向诱导分化能力逐渐降低。结论提示在选择胎盘间充质干细胞作为种子细胞时,应注意选择适宜的扩增代数,以便既能保证足够的细胞数目又能保留细胞最佳的分化能力。

人脐带间充质干细胞对人真皮成纤维细胞增殖和细胞外基质基因表达的影响

目的探讨人脐带间充质干细胞(hucMSCs)对人真皮成纤维细胞(HDFib)增殖与细胞外基质相关基因表达的影响及其可能机制。方法采用Ⅱ型胶原酶消化法从新生儿脐带中分离制备hucMSCs,用流式细胞术鉴定P3代hucMSCs表面标记抗原,用油红O染色、茜素红S染色和Masson染色进行间充质干细胞三向分化能力鉴定;随后与P3代HDFib进行transwell共培养,对照组transwell小室上添加等量培养基,观察24、48和72h时两组HDFib的细胞形态,CCK8法进行细胞增殖检测,qRT-PCR法测定培养24和48h时HDFib主要细胞外基质蛋白collagenⅠ、elastin、fibronectin、MMP-1和细胞信号转导相关基因PI3K、Akt、p38和caspase3 mRNA表达水平。结果制备获得的hucMSCs呈典型成纤维细胞样并贴壁生长,其表面间充质干细胞标志性抗原CD105、CD90、CD73阳性表达率分别为96.97%、99.75%和99.81%,诱导培养16 d后出现明显的成脂、成骨和成软骨细胞特性。hucMSCs共培养处理24、48和72 h,HDFib细胞存活率较对照组分别显著增加了7.29%(P<0.01)、25.82%(P<0.05)和11.74%(P<0.05),与形态学观察结果一致。qRT-PCR结果显示,hucMSCs共培养处理24 h,HDFib elastin和fibronectin基因表达分别上调为对照组的1.45倍(P<0.01)和1.30倍(P<0.05),PI3K mRNA水平上调为对照组的1.19倍(P<0.05);共培养48 h时,collagen I、elastin、fibronectin和PI3K、Akt分别上调2.60倍(P<0.001)、3.66倍(P<0.05)、3.45倍(P<0.01)和1.43倍(P<0.05)、1.65倍(P<0.05),MMP-1、p38和caspase3转录水平显著降低至对照组的0.70倍(P<0.01)、0.60倍(P<0.01)和0.86倍(P<0.05)。结论hucMSCs能够显著促进正常HDFib增殖,同时提高HDFib I型胶原、弹性蛋白和纤维粘连蛋白转录水平,是理想的皮肤组织工程学种子细胞。hucMSCs对HDFib细胞外基质的调节作用可能与激活HDFib皮肤创伤修复信号通路PI3K/Akt、下调细胞外基质调节基因p38、凋亡基因caspase3的mRNA水平有关。

程控降温法与二步法对胎盘间充质干细胞冻存效果的影响

目的观察对比程控降温法与二步法对胎盘间充质干细胞深低温冻存效果的影响。方法分别采用程控降温法和二步法对3个批次的pMSCs进行液氮冻存,3个月后进行复苏,测定细胞存活率、活细胞数,观察体外培养1~4 d时的细胞形态,CCK8法进行细胞增殖检测,同时用流式细胞术鉴定细胞表面标记抗原,用油红O染色、茜素红S染色和Masson染色进行细胞三向分化能力鉴定。结果程控降温法对比二步法冻存的细胞活率在冻存前、复苏后均无显著差异(P>0.05)。倒置显微镜观察细胞形态,均在24 h时贴壁,呈短梭形,96 h时细胞密度达到95%左右,均匀铺满视野。增殖测定结果显示,培养第3~5天为两组细胞的对数生长期,第5天时增殖倍数达到最高,分别为第1天的6.44倍和6.29倍,经过短暂的平台期后进入衰亡期,增殖趋势一致;但分别在第4天(P<0.01)、第6天(P<0.05)和第7天(P<0.05)时,程控降温法冻存的细胞存活率极显著或显著高于二步法冻存的细胞。两种方法冻存细胞的表面标志性抗原CD73、CD90、CD105阳性细胞数百分比分别为99.85%、99.87%、96.45%和99.73%、99.73%、96.17%。诱导14 d后两组pMSCs均出现明显的成脂、成软骨、成骨细胞特性。结论采用程控降温法或二步法冻存pMSCs均能很好地维持细胞活力及生物特性,在条件允许情况下宜采用程控降温法,以获得增殖能力更好的种子细胞。

人脐带间充质干细胞对HaCaT细胞增殖与迁移的影响

目的探讨人脐带间充质干细胞(hucMSCs)对人表皮角质形成细胞增殖与迁移的影响及其可能机制。方法采用Ⅱ型胶原酶消化法从新生儿脐带中分离制备hucMSCs,用流式细胞术鉴定P3代hucMSCs表面标记抗原,用油红O染色、茜素红S染色和Masson染色进行间充质干细胞三向分化能力鉴定;以人表皮角质细胞系HaCaT为研究模型,在transwell上室接种P3代hucMSCs进行共培养,显微镜观察24、48和72 h时HaCaT的细胞形态,CCK8法检测细胞增殖状况,划痕法检测细胞12 h和24 h迁移率,qRT-PCR法测定HaCaT细胞迁移、增殖相关生长因子KGF-2、FGFR-2、TGF-β1,以及细胞外基质蛋白Fibronectin、MMP-1和CollagenⅠmRNA表达水平。结果hucMSCs呈成纤维细胞样贴壁生长,其表面间充质干细胞标志性抗原CD105、CD90、CD73阳性表达率分别为98.35%、99.97%和99.94%,不表达CD45、CD34、CD14和CD19,在诱导培养16d后出现明显的成脂、成骨和成软骨细胞特性。hucMSCs共培养24、48和72 h,HaCaT细胞存活率较对照组分别显著增加了(20.42±3.90)%(P=0.002)、(36.30±8.08)%(P=0.001)和(27.31±10.04)%(P=0.012),与形态学观察结果一致。划痕后继续培养12h,对照组、共培养组HaCaT的空白区域面积分别为(36354.19±1705.32)μm^2、(29497.63±1286.49)μm^2(P=0.045),培养24 h,其空白区域面积分别减少为(13086.65±1695.85)μm^2、(2895.69±224.32)μm^2(P=0.014)。qRT-PCR结果显示,共培养处理24h后huc MSCs组KGF-2、TGF-β1基因表达分别上调为对照组的1.24倍和1.92倍;共培养48 h后KGF-2、TGF-β1和FGFR-2分别上调2.01倍、2.26倍和1.34倍,细胞外基质蛋白Fibronectin转录水平显著上调为对照组的1.59倍,MMP-1降低至对照组的0.52倍。结论hucMSCs能够显著促进HaCaT细胞的增殖与迁移,这可能与hucMSCs调节HaCaT增殖、迁移相关生长因子及细胞外基质蛋白的基因表达水平有关,提示hucMSCs是有潜力的表皮创伤愈合种子细胞。

人胎盘间充质干细胞微环境对心肌细胞增殖的影响

目的观察胎盘间充质干细胞微环境对心肌细胞增殖的影响。方法用胎盘间充质干细胞培养基上清模拟胎盘间充质干细胞微环境,与H9C2心肌细胞transwell共培养(微环境组),观察其对H9C2细胞的生长状态、细胞增殖影响情况。同时设置10%FBS的DMEM为空白对照、pMSC/H9C2transwell共培养为阳性对照(pMSC组),倒置显微镜观察心肌细胞增殖状态;共培养72 h后将H9C2胰酶消化按5×10~6/ml每孔进行96孔板铺板,分别在24和48 h进行CCK8细胞增殖检测。结果与对照组相比,胎盘间充质干细胞培养基上清与心肌共培养72 h后心肌细胞密度达到80%以上,显著高于对照组,与pMSC组无明显差异。共培养处理后的心肌细胞培养24和48 h增殖结果均显示,微环境组与pMSC组心肌细胞增殖高于对照组,差异极显著(P<0.01),24 h增殖结果显示pMSC组与微环境组心肌细胞增殖差异极显著(P<0.01),而48 h增殖结果显示pMSC组与微环境组心肌细胞增殖差异不显著(P>0.05)。结论胎盘间充质干细胞微环境与胎盘间充质干细胞对心肌细胞的增殖均具有显著的促进作用,提示胎盘间充质干细胞微环境有望部分替代胎盘间充质干细胞的心肌损伤修复治疗功能。

不同存储温度的huMSC-exo对UVB辐照HaCaT细胞的修复作用研究

目的探究了不同存储温度的huMSC-exo对UVB辐照HaCaT细胞的修复作用,为外泌体存储选择适宜的温度条件提供理论依据。方法采用超速离心法从huMSC培养基上清中提取外泌体,用Western blot、纳米颗粒跟踪分析技术和透射电镜技术进行表征,并置于–80、–20、4、25和45℃存储1、3、7、14、30、50、100和150 d。构建UVB辐照HaCaT光老化细胞模型,用huMSC-exo处理24 h后观察细胞形态、检测细胞存活率、SA-β-gal活性、T-SOD活性、MDA和LDH含量。结果huMSC-exo呈具有清晰膜的茶托样结构,尺寸中位数为114 nm,30~150 nm囊泡数量占比约61.42%,表达外泌体表面标记蛋白CD9、CD63和CD81。–80℃和25℃存储1~150 d的huMSC-exo能显著提高UVB辐照HaCaT细胞存活率、恢复细胞形态、降低SA-β-gal活性、部分恢复细胞T-SOD、MDA和LDH水平;–20℃存储的huMSC-exo对HaCaT的增殖活性、细胞形态和SA-β-gal活性有恢复作用;4℃存储的huMSC-exo能减轻细胞老化水平;45℃存储的huMSC-exo无显著修复作用。结论–80℃、25℃存储的huMSC-exo能够显著恢复UVB辐照引起的HaCaT损伤,–20℃、4℃huMSC-exo作用效果次之,45℃的huMSC-exo无显著影响,提示–80℃和25℃能够较好地维持huMSC-exo的生物学功能。

液氮冻存时间对605份脐血造血干细胞质量和临床移植效果的影响

目的 探讨液氮冻存时间对脐血造血干细胞质量和临床移植效果的影响.方法 对上海脐血库已经应用于临床移植的605份脐血进行研究,脐血平均冻存时间为820（88～ 2651）d,测定脐血复苏之后的有核细胞、CD34＋细胞数量、细胞回收率、细胞活力,粒-单核细胞集落形成单位（CFU-GM）,结合脐血冻存时间、临床移植效果进行统计分析.结果 复苏后细胞回收率、细胞活力与冻存时间无显著相关性,CFU-GM平均（109.6～ 105.7）个/1×10^5,随冻存时间延长逐渐降低（P=0.011）.临床移植患者的造血重建时间、植入失败率、急性移植物抗宿主病、总体生存率与脐血冻存时间长短无显著相关性.结论 深低温冻存时间长短对脐血复苏后细胞回收率、细胞活力、临床移植效果无显著影响,冻存时间较长的脐血复苏后CFU-GM在正常标准范围内略有下降,保存3～7年的脐血仍能维持正常细胞活性和功能、达到良好的临床移植效果.

137例单份非亲缘脐血造血干细胞移植患者的临床研究

目的 分析单份非亲缘脐血造血干细胞移植（sUCBT）的预后影响因素及脐血深低温冻存时间长短与细胞活力、移植预后的相关性.方法 回顾性研究2007年3月15日至2013年12月26日使用上海脐血库提供的脐血进行sUCBT的来自28家医院的137例患者,脐血平均冻存时间为698（96～1 968）d,复苏后细胞活力平均为87.4％.结果 脐血冻存2年以下及2年以上两组患者,细胞活力及患者的造血重建天数、植入失败率、急性移植物抗宿主病（GVHD）发生率及总体生存（OS）率差异均无统计学意义,两组5年OS率分别为55.6％和67.9％ （P=0.124）.2011年以后移植的患者OS率显著高于2011年及以前移植的患者（79.6％对48.7％,P=0.001）.多因素分析中,年龄＞16岁（RR=2.830,P=0.027）及2011年及以前移植（RR=0.203,P＜0.001）是治疗相关死亡的危险因素.结论 近两年sUCBT预后明显改善,脐血复苏后细胞活力、移植临床预后与脐血冻存时间长短无关.

单份与双份非亲缘脐血移植治疗血液疾病临床效果的比较

目的:分析比较单份与双份非亲缘脐血造血干细胞移植治疗血液疾病的临床效果。方法:回顾性分析2006年至2016年国内8家移植中心185例单份脐血干细胞移植(single-unit umbilical cord blood transplantation,SU-UCBT)与66例双份脐血干细胞移植(double-unit umbilical cord blood transplantation,DU-UCBT)病例临床资料,比较SU-UCBT和DU-UCBT 2种移植方式的植入率、中性粒细胞和血小板植入时间,恶性和非恶性血液病患者接受SU-UCBT和DU-UCBT后急性移植物抗宿主病(acute graft vs host disease,a GVHD)发生情况和受者生存率。结果:SU-UCBT和DU-UCBT受者植入率分别为78.9%和70.7%,其中恶性血液病患者植入率SU-UCBT为89.1%,DU-UCBT为82.5%。非恶性血液病患者SU-UCBT和DU-UCBT植入率分别为64.0%和53.8%,SU-UCBT和DU-UCBT的植入率相似(P>0.05)。SU-UCBT和DU-UCBT受者中性粒细胞植入时间中位数都为18 d,血小板植入时间中位数分别为40 d和27 d,无显著差异(P>0.05)。SU-UCBT和DU-UCBT受者Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ和Ⅳ度a GVHD发生率分别为22.6%、22.6%、8.2%、12.3%和21.3%、14.9%、10.6%、10.6%,均无显著差异(均P>0.05)。SU-UCBT和DU-UCBT受者中位生存时间分别为1 460 d(17~2 200 d)和988 d(21~2 200 d),6年累积存活率分别为42.5%和40.4%,无显著差异(P>0.05)。结论:SU-UCBT和DU-UCBT植入成功患者的中性粒细胞和血小板植入时间、a GVHD发生率、存活时间及6年累积存活率均无显著差异,提示DU-UCBT是安全有效的移植选择。但仍需完善SU-UCBT和DU-UCBT评价体系及进一步探究DU-UCBT的植入机制,以便指导科学地选择UCBT方式。