移植PEDF-hUCMSCs在治疗大鼠视网膜色素变性的作用

目的:探讨移植色素上皮衍生因子(pigment epithelialderived factor,PEDF)蛋白修饰人脐带来源间充质干细胞(human umbilical cord-derived mesenchymal stem cells,hUCMSCs)在治疗大鼠视网膜色素变性的作用。方法:分离和培养hUCMSCs,以PEDF重组慢病毒转染hUCMSCs。实验RCS大鼠(royal college of surgeon rat,RCS)随机分为3组干预,每组8只。实验组视网膜下腔注射PEDF-hUCMSCs;hUCMSCs对照组注射等量hUCMSCs,PBS对照组注射等量PBS。注射后4、8wk观察视网膜电图(electroretinogram,ERG),检测视网膜外核层厚度,观察绿色荧光蛋白(green fluorescent protein,GFP)了解细胞的存活情况,通过视网膜切片免疫荧光染色观察其在体吞噬功能,通过MERTK蛋白的表达检测重建吞噬能力来评价疗效。结果:携带PEDF基因的重组慢病毒载体,能高效感染hUCMSCs,感染后的hUCMSCs进行传代培养,慢病毒可延长目的基因在细胞内的表达。移植后8wk视功能上ERG中b波幅值实验组明显高于对照组,移植后4、8wk形态学上视网膜外核层(outer nuclear layer,ONL)厚度实验组均高于对照组,差异均有统计学意义(P<0.05)。移植后4、8wk时GFP染色发现转染PEDF慢病毒的hUCMSCs细胞均能在视网膜下腔存活,视网膜切片行免疫荧光染色显示移植的PEDF-hUCMSCs对感光细胞脱落的外节碎片有吞噬作用。移植后4、8wk时MERTK蛋白的表达检测实验组蛋白条带灰度值明显高于对照组,提示实验组中MERTK蛋白表达也明显增加,RPE重建吞噬能力提高。结论:移植PEDF蛋白修饰hUCMSCs对RCS大鼠视网膜有保护作用。

色素上皮衍生因子修饰的人脐带间充质干细胞构建方法

目的:构建携带色素上皮衍生因子(pigment epithelialderived factor,PEDF)基因的重组慢病毒,感染人脐带间充质干细胞(human umbilical cord-derived mesenchymal stem cells,hUCMSCs),探讨PEDF在hUCMSCs中的表达及重组慢病毒对hUCMSCs活性的影响。方法:利用pLenti-CMV-hChR2-EYFP载体系统,构建携带PEDF基因的重组慢病毒pLenti-CMV-PEDF-EYFP,进一步感染hUCMSCs,获得携带PEDF基因的hUCMSCs(PEDF-hUCMSCs),激光共聚焦显微镜和ELISA法检测PEDF-hUCMSCs的PEDF蛋白表达情况,采用CCK8法检测PEDF-hUCMSCs的活性。通过观察细胞形态和流式细胞术检测验证重组慢病毒pLenti-CMV-PEDFEYFP感染hUCMSCs后对细胞传代、细胞表型的影响。结果:成功构建携带PEDF基因的重组慢病毒pLentiCMV-PEDF-EYFP,高效感染hUCMSCs,获得的PEDFhUCMSCs能有效表达PEDF蛋白,检测结果显示重组病毒感染组细胞与空白对照组细胞活性无统计学差异(P>0.05)。重组慢病毒pLenti-CMV-PEDF-EYFP感染对hUCMSCs的增殖能力、细胞形态和细胞表型没有明显改变。结论:携带PEDF基因的重组慢病毒pLenti-CMV-PEDFEYFP修饰的PEDF-hUCMSCs能有效表达PEDF蛋白。