基于酵母双杂交文库鉴定鸡PGCs形成过程中的关键泛素化修饰酶

试验拟筛选与C2EIP互作的蛋白,构建调节PGCs形成过程的泛素化E3连接酶复合体。通过逆转录和同源重组等方法构建鸡PGCs酵母文库;将C2EIP连入诱饵空载体pGBKT7中,并转化酵母感受态细胞进行诱饵载体(C2EIP-pGBKT7)的毒性和自激活检测;将酵母文库与诱饵载体菌液共培养后,通过涂板筛选阳性克隆并进行测序和生物信息学分析筛选互作蛋白。结果显示:成功构建了鸡PGCs酵母文库,其滴度为3.0×10^(6)cfu/mL,总库容为1.5×10^(7)cfu,且重组率为100%,符合筛库要求。成功构建无毒性和不能自激活的C2EIP-pGBKT7诱饵载体,能够用于后续的文库筛选。C2EIP-pGBKT7诱饵载体菌液与酵母文库共培养后,通过PCR测序与蛋白序列分析后共筛选了36个C2EIP的互作蛋白,其中RCJMBM04和CCDC174蛋白功能域分析发现分别具有典型的RING功能域和PPXY基序,进行的生物信息学分析发现WWP1和WWP2具有典型的WW功能域,能够与CCDC174结合。研究表明,试验成功鉴定了C2EIP/RCJMB04/CCDC174/WWP泛素化E3连接酶复合体,为后续研究泛素化修饰调控鸡PGCs形成机制奠定理论基础。

STAT1和组蛋白乙酰化修饰调控鸡lncRNA-BMP4转录研究

【目的】探讨影响鸡长链非编码RNA(long chain noncoding RNA,lncRNA)-骨形态发生蛋白4(bone morphogenetic protein 4,BMP4)启动子转录的因素,并对调控lncRNA-BMP4特异表达的分子机制进行研究。【方法】以鸡肌肉基因组为模板,PCR扩增并克隆鸡lncRNA-BMP4的启动子区,构建lncRNA-BMP4-EFGP载体,对lncRNA-BMP4启动活性进行定性分析;通过染色体5′-末端缺失的方法和双荧光素酶系统检测筛选lncRNA-BMP4启动子核心区域。通过在线工具预测分析调控核心区域的潜在转录因子;利用点突变和双荧光素酶系统筛查真正影响lncRNA-BMP4的转录因子;通过表观修饰验证DNA甲基化、组蛋白乙酰化对lncRNA-BMP4的转录调控作用。【结果】试验成功扩增lncRNA-BMP4启动子片段1288 bp,与pEGFP-N1载体连接后转染鸡成纤维细胞系(DF-1)具有荧光表达,说明lncRNA-BMP4启动子有启动活性。染色体5′-末端缺失和双荧光素酶系统检测发现,核心启动子区域为―832~―651 bp,Jaspar数据库分析筛选到核心区域的转录因子有SOX17、CREB1及STAT1。双荧光素酶系统检测发现,STAT1可促进lncRNA-BMP4核心启动区域的活性;DNA甲基化抑制剂5′-Azacd对lncRNA-BMP4的转录活性未有任何影响,而组蛋白乙酰化抑制剂TSA可极显著提高其转录活性(P<0.01)。【结论】提示lncRNA-BMP4的转录活性受STAT1和组蛋白乙酰化的正调控,而DNA甲基化不影响其转录。研究结果为详细解析lncRNA-BMP4的功能和分子机制提供了理论依据。

基于“学生满意度模型”剖析在线课程教师教学能力的需求

文章以《动物遗传学》在线开放课程为研究环境,通过构建"学生满意度"模型开展问卷调查,并根据"持续学习"维度系统,剖析当前环境下影响教学质量的关键因素,为提高在线开放课程的教学质量提供基础模型。

原始生殖细胞关键基因CC2EIP的生物信息学分析

为了对前期高通量测序结果筛选获得的鸡原始生殖细胞(PGCs)特异表达的未知转录本(C2EIP)进行系统的功能注释,试验通过PCR技术克隆C2EIP全长,并结合生物信息学技术对C2EIP的理化性质进行系统分析。结果显示:通过PCR成功克隆C2EIP全长,为714 bp,测序比对结果准确。生物信息学分析表明:C2EIP主要在细胞质中表达,存在磷酸化和糖基化位点,在生物进化过程中物种间保守性较差,禽类中保守性较高;C2EIP具有泛素化连接酶E3和磷酸化雷帕霉素靶蛋白复合体功能。试验结果为进一步研究C2EIP的功能和分子机制奠定了理论基础。

技能大赛在动物科学专业中的重要性及对教学工作的启示

本文以动物科学专业教学为例,从专业育人的角度,围绕技能大赛在动物科学专业中的重要性展开探究。结合动物科学专业特点对其技能大赛具体内容进行了简单介绍,深入分析了技能大赛在动物科学专业中的重要性,探究技能大赛对动物科学专业教学工作的启示。

干扰TLR4对LPS感染鸡HD11细胞免疫炎症的影响

Toll样受体(toll-like receptor,TLR)成员TLR4可识别革兰氏阴性细菌的脂多糖(lipopolysaccharide,LPS),参与宿主免疫炎症反应。研究旨在通过干扰基因TLR4,以阐释TLR4对炎性细胞因子基因表达水平和鸡巨噬细胞HD11凋亡的影响,为完善TLR4在鸡免疫反应中的分子调控机制提供一定依据。不同剂量LPS感染鸡HD11细胞,检测感染后不同时间点TLR4及免疫炎性相关基因表达量。设计3条TLR4基因干扰片段,分别转染鸡HD11细胞,qRT-PCR和流式分别检测LPS感染前后TLR4和免疫炎性相关基因表达量以及细胞凋亡。结果显示,1μg/mL LPS感染8 h时诱导基因TLR4、IL-1β、IL-8和IL-6的表达效果最佳。成功干扰TLR4基因后,LPS感染鸡HD11细胞时促炎因子基因IL-1β、IL-6、IL-8和TNF-α表达量显著性降低(P<0.05),且有效抑制细胞凋亡;但抗炎因子基因TGF-β和IFN-α的表达水平不受影响(P>0.05)。结果说明,调节TLR4基因的表达可直接影响细胞对LPS的炎症反应,为控制过度炎症反应提供新思路和干预靶点,对缓解应激性病理损伤和提高家禽健康具有实践意义。

鸡RIPK2基因启动子核心区域及生物信息学分析

为了对前期高通量测序筛选出的抗禽致病性大肠杆菌鸡中高表达RIPK2基因进行结构和蛋白功能探析,试验通过PCR技术克隆鸡RIPK2起始密码子前3 201 bp的启动子区,构建系列启动子区缺失载体,转染HD11细胞,双荧光素酶试验检测启动子核心区域;5-Azadc、TSA或5-Azadc和TSA联合处理鸡RIPK2启动子;并结合生物信息学技术对鸡RIPK2蛋白的理化性质进行系统分析。结果显示:通过PCR技术成功克隆鸡RIPK2启动子区不同片段,单、双酶切测序结果准确;-2 300~+38 bp区域是鸡RIPK2基因启动子的基本活性区域,-2 300~-1 839 bp之间存在AP-1、CEBPA和NFκB等重要正调控元件。用5-Azadc、TSA以及5-Azadc和TSA联合分别处理鸡RIPK2启动子,均可提高其转录活性。生物信息学分析表明:鸡RIPK2蛋白在细胞核中表达;在生物进化进程中物种间保守性一般,禽类中保守性很高;存在自身磷酸化位点。试验结果为进一步研究鸡RIPK2基因转录调控机制和蛋白功能奠定了基础。