筛选普氏原羚粪便DNA中微卫星引物并应用于个体识别

为了更好地保护极度濒危的普氏原羚物种,选择非损伤性样品-粪便作为研究材料,选用10对非洲糜羚微卫星引物和10对绵羊微卫星引物作为筛选普氏原羚基因组DNA微卫星位点的引物。通过非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳检测微卫星PCR的扩增产物,结果发现20对引物中有8对引物在普氏原羚基因组DNA中扩增出了多态性位点。通过等位基因数目和等位基因频率对这8个位点的基因杂合度、多态性信息含量、有效等位基因数进行了计算,结果发现这8个位点在39个普氏原羚粪便样品中的基因杂合度介于0.71～0.84,平均杂合度为0.78;多态性信息含量介于0.79～0.66,平均多态信息含量为0.73;有效等位基因数介于3.40～6.08,平均有效等位基因为5.98,这表明所筛选到的8个微卫星基因座在研究普氏原羚粪便样品中均为中高度多态性基因座,具有比较明显的遗传变异,完全适合普氏原羚各种分子遗传分析。因此试验应用这8对多态性引物对39个粪便样品的个体进行识别,发现这39个粪便样品来自35个不同的个体。

普氏原羚粪便DNA提取方法的改进与比较

为提高普氏原羚粪便DNA提取效果,在总结传统提取粪便DNA方法的基础上,设计了新的提取方法。该方法以NaCl替代TE溶解粪便样品,增加溶菌酶用量以减少蛋白酶K用量。经琼脂糖凝胶电泳和PCR扩增12SrRNA片段对改进方法与传统提取粪便DNA方法进行比较,发现用改进方法提取的DNA质和量均比传统方法好,且可满足一般分子生物学实验的需要。扩增的普氏原羚12SrRNA片段已经测序,并递交GenBank,登录号为EU247756。新方法不仅克服了传统提取法中DNA降解严重的问题,而且有效地解除了粪便DNA对Taq酶的抑制作用,为普氏原羚遗传多样性保护提供技术支持。