猪Linda病毒巢式RT-PCR检测方法的建立

猪Linda病毒能引起仔猪先天性震颤,严重危害养猪业的发展,目前在我国暂未发现感染病例。本研究根据猪Linda病毒Core-E~(ms)基因序列,设计并合成巢式RT-PCR引物,通过对退火温度、引物浓度等进行优化,建立了猪Linda病毒巢式RT-PCR检测方法。结果显示,该方法具有良好的特异性,与非洲猪瘟病毒、猪瘟病毒、猪繁殖与呼吸综合征病毒、猪伪狂犬病病毒、猪圆环病毒2型均无交叉反应;敏感性好,对慢病毒阳性对照品的最低检出限为10~1 copies/μL,比普通RT-PCR灵敏10倍。使用该方法检测模拟病毒样品,发现最低检出限为10~1 TU/mL,与荧光定量RT-PCR方法一致。本研究首次建立了可检测猪Linda病毒的巢式RT-PCR方法,其特异性强、灵敏度高,为在口岸以及条件有限的场地对猪Linda病毒进行精准且快速的检测提供了有效技术手段,也为防范Linda病毒传入提供了有力技术支撑。

纳米孔测序技术在实蝇类害虫检疫鉴定中的应用

【目的】纳米孔测序技术是单分子实时测序技术的一种,正在被广泛应用于临床快速诊断及微生物检测等领域。本研究以实蝇这一类重要的检疫性有害生物为例,探究该技术在昆虫检疫鉴定中应用的可行性,为昆虫检疫鉴定提供新方法。【方法】分别采用一代测序技术和纳米孔测序技术,对14种经形态学鉴定的实蝇成虫进行DNA条形码测序,通过BOLD和NCBI数据库对测序结果进行比对分析,并比较2种测序技术所得序列结果准确性的差异。【结果】通过纳米孔测序,14个实蝇样品在44 min内获得181Mb bases,每个样品平均得到11280条reads,单个reads的准确度为92.10%~94.53%;经一致性序列校正,所有实蝇样品均可得到与一代测序结果完全一致的序列,序列分析结果与形态学鉴定结果完全一致。【结论】采用本研究的实验流程和数据分析方法,纳米孔测序技术可以应用于实蝇类害虫的检疫鉴定,测序结果准确、高效;本研究提供的实验方案同样适用于基于扩增子测序的物种鉴定,满足大规模样品的高通量精准鉴定需求。

非洲猪瘟病毒MGF-505R基因缺失株双重荧光RPA检测方法的建立及应用

旨在建立一种快速现场筛查非洲猪瘟病毒(ASFV)基因缺失株的方法,以便鉴别我国复杂的ASFV感染情况。通过分析国内ASFV流行态势,选择MGF-505R基因及B646L基因,设计特异性引物及exo探针,对其进行敏感性、特异性分析,并进行临床应用。利用双重-重组酶聚合酶扩增(RPA)方法检测ASFV MGF-505R及B646L基因,结果显示:检测时间在15 min内,最低检测限均为10 copies/反应,且与猪瘟病毒、猪繁殖与呼吸综合征病毒、猪圆环病毒2型等均无交叉反应;利用所建立方法对266份临床样品进行检测,结果与世界动物卫生组织(WOAH)推荐荧光PCR检测方法的符合率为100%。建立的ASFV MGF-505R基因缺失株的荧光RPA检测方法适配可移动式荧光RPA检测仪,具有快速、灵敏度高、特异性强的优点,适用于ASFV现场快速临床检测,为非洲猪瘟疫情防控提供一种新的筛查手段。

重组酶聚合酶扩增核酸试纸条快速检测诺如病毒方法的建立与应用

旨在建立快速检测GⅠ型诺如病毒的方法与快速检测GⅡ型诺如病毒的方法。分别以GⅠ型NoV特异性保守序列作为靶序列设计并合成RPA引物Nov-GⅠ-F、Nov-GⅠ-R与探针Nov-GⅠ-probe、以GⅡ型NoV特异性保守序列作为靶序列设计并合成RPA引物Nov-GⅡ-F、Nov-GⅡ-R与探针Nov-GⅡ-probe,利用RPA检测试剂盒建立RPA扩增体系,并通过核酸检测试纸条对扩增产物进行分析鉴定。通过检测不同拷贝数的重组GⅠ型NoV阳性质粒对GⅠ型NoV快速检测方法的灵敏度进行评价,通过检测不同拷贝数的重组GⅡ型NoV阳性质粒对GⅡ型NoV快速检测方法的灵敏度进行评价,并与普通PCR方法和实时荧光PCR方法进行比较;以星状病毒、MS2噬菌体基因组、人轮状病毒和人腺病毒重组质粒作为模板对GⅠ型NoV快速检测方法与GⅡ型NoV快速检测方法的特异性进行评价;应用建立的两种方法对市场上采集的20份食品样品进行GⅠ型NoV检测与GⅡ型NoV检测。GⅠ型NoV快速检测方法与GⅡ型NoV快速检测方法检测到最低质粒拷贝数均为101 copies/μL,且两种检测方法对其余病毒均具有良好特异性;对于从市场采集的潜在携带NoV的食品样品进行检测,结果均为阴性。本研究建立的针对GⅠ型NoV快速检测方法与GⅡ型NoV快速检测方法相较于普通PCR与实时荧光PCR具有检测时间短、特异性强、灵敏度高以及检测操作简单快捷的优点,更适用于市场流通领域食品及医学检测等现场快速检测的应用。

饲料用鱼类、哺乳类及禽类源性成分三重TaqMan-MGB荧光PCR检测方法的建立及应用

为建立饲料用鱼类、哺乳类及禽类源性成分的广谱、快速检测方法,收集Genbank中鳕鱼、鲈鱼、沙丁鱼等鱼类,猪、牛、羊等哺乳类以及鸡、鸭、鹅等禽类的18S rRNA基因序列,分别设计特异性扩增引物和MGB-TaqMan荧光探针,通过优化反应体系和条件,每种引物探针体系均可以特异性检测目标物种类型而与其他物种无交叉反应。3套引物探针体系组合后可同时检测鱼类、哺乳类及禽类源性成分,三重荧光PCR方法的最低检测限可低至0.002 ng或0.02 ng基因组/反应,变异系数均小于2%。利用建立的三重荧光PCR方法检测35份进境及国产饲料样本,从2份进口饲料及1份国产饲料中检出非标定动物源性成分,结果与行业标准方法的检测结果一致,符合率100%。结果表明,本研究建立的三重荧光PCR方法具有特异性、敏感性高、重复性好等优点,为包括饲料在内的动物产制品源性成分定性分析提供了新的技术分析手段。

基于GARP的杏小食心虫在中国的潜在分布研究

杏小食心虫[Grapholitha prunivora (Walsh)]是多种核果的重要害虫。本研究在概述其分布、寄主及生物学特性的基础上,利用GARP生态位模型结合Desktop ArcGIS对杏小食心虫在中国的潜在分布进行了预测。研究表明:杏小食心虫在我国具有较大面积的适生范围,主要分布在北纬18°以北地区。根据预测结果提出针对杏小食心虫的风险管理措施。

水稻干尖线虫快速分子检测技术研究

根据水稻干尖线虫的rDNA-ITS序列,设计出水稻干尖线虫的特异性引物,利用PCR技术对水稻干尖线虫(Aphelenchoides besseyi)部分rDNA-ITS1和部分5.8S基因核苷酸序列进行特异性扩增。实现了单条活的或4%的甲醛(FG)固定的水稻干尖线虫的快速检测。

贝莱斯芽孢杆菌生防次级代谢产物研究进展

贝莱斯芽孢杆菌(Bacillus velezensis)是生防芽孢杆菌中的重要代表,作为微生物农药的核心菌种,已被广泛应用于作物病害生物防治。贝莱斯芽孢杆菌具有植物内生性,其生防作用机制主要包括产生次级代谢产物对抗植物病原物;改善宿主植物根际微生物群落,促进宿主营养和生长;激发宿主植物产生防御反应,诱导植物获得系统抗性。其中,产生次级代谢产物是其最重要的生防作用机制。贝莱斯芽孢杆菌含有多个编码生物合成次级代谢产物的基因簇,其中包括编码聚酮化合物合酶(PKS)和非核糖体肽合成酶(NRPS)的基因簇,同时存在核糖体途径合成次级代谢产物基因簇。通过非核糖体途径可产生脂肽类化合物、聚酮类化合物、二肽和铁载体;通过核糖体途径产生小菌素、细菌素、羊毛硫抗生素。这些具有生物活性的次级代谢产物成为了天然新药和候选抗生素的储存库,对于解析生防菌作用机制具有重要意义。本文综述了贝莱斯芽孢杆菌的命名与更迭,产生次级代谢产物的类型、合成与调控基因以及靶标病原菌,以期为生防菌株的改良和生物农药的研发提供参考。

植物检疫实验室的合同评审

本文对合同评审的概念进行了剖析,归纳了植物检疫实验室合同评审的基本过程,并对植物检疫实验室的任务来源进行了系统分类,提出了各类任务的评审方法。本文对合同评审的概念进行了剖析,归纳了植物检疫实验室合同评审的基本过程,并对植物检疫实验室的任务来源进行了系统分类,提出了各类任务的评审方法。

斑皮蠹属害虫的检疫重要性

本文对皮蠹科(Dermestidae)斑皮蠹属(Trogoderma)害虫的经济重要性及传播蔓延进行了评述,对有害种类的危害性进行了比较。在基本上明确了我国该属有害种类的基础上,认为谷斑皮蠹(T.granar-iumEverts)、墨西哥斑皮蠹(T.anthrenoidesSharp)、肾斑皮蠹(T.inclusumLeConte)和胸斑皮蠹(T.sternaleJayne)应作为我国防范的重点。

鳞球茎茎线虫实时荧光PCR检测技术的研究

传统的线虫形态学鉴定存在经验性强和幼虫难以鉴定等不足。本文根据线虫ITS基因序列多态性 ,设计鳞球茎茎线虫 (Ditylenchusdipsaci)特异的TaqMan探针 ,建立了实时荧光PCR检测方法。对茎线虫属的鉴定实验表明 :只有鳞球茎茎线虫产生特异性荧光信号 ,同属的其他线虫均检测到荧光信号。整个检测过程只需 30min到 2h ,能够满足口岸检验检疫快速通关的要求。

诺如病毒的流行、诊断与防控建议

诺如病毒是一种重要的人畜共患病毒,也是一种重要的食源性疾病病毒,该病毒可以通过肉、乳、鱼、贝类等多种生鲜动物及其制品的携带而传播,短时间内即可引起聚集群体的集体发病,发生呕吐、腹泻等急性肠胃炎症状,严重时还会给人类生命带来重大威胁。由于其危害多种动物及其制品的质量安全,且每年在世界范围内频繁发生,因此,加强市场上活动物及动物制品的检验检疫,在市场流通环节对疫病进行把控,做好市场生物安全监管工作,提高对该病的正确认识与精准检验检测,能够有效改善我国动物及其产品的质量安全,维护我国人民身体健康。

猪巨噬细胞培养模型的建立与应用

本研究建立了猪肺泡巨噬细胞(porcine alveolar macrophage,PAM)的体外细胞培养模型,并利用该模型进行了病毒及遗传学操作等方面的初步应用。分离猪肺泡巨噬细胞后,利用多种培养条件进行培养和观察,通过光学显微镜对培养后的PAM进行形态学观察,并利用脂多糖诱导其分化,检测分泌细胞因子的能力,建立PAM细胞体外培养模型。为进一步验证PAM细胞模型的功能,利用对表达红色荧光蛋白的大肠埃希菌(E.coli)检测PAM的吞噬功能;利用Porcine Reproductive and Respiratory Syndrome Virus(PRRSV)疫苗毒鉴定其扩繁病毒的能力;利用体外包装的慢病毒对PAM细胞进行基因操作,并对慢病毒感染前后病毒的吞噬功能进行研究。结果显示,本研究建立PAM细胞培养模型,细胞生长状态良好且对E.coli有强的吞噬能力;病毒感染实验显示,诱导产生的猪PAM细胞能有效的扩繁PRRSV疫苗毒;体外包装的慢病毒也能感染本研究的细胞模型,且感染后PAM细胞仍然对细菌具备吞噬功能。本研究成功建立了PAM细胞体外培养模型,为研究PAM细胞的免疫分化功能、病毒的感染免疫细胞的免疫机制等提供了坚实的研究基础。

我国进境植物检疫性细菌检疫鉴定标准现状分析

有害生物检疫鉴定标准是对有害生物进行检疫鉴定的重要依据,建立健全进境植物检疫性有害生物检疫鉴定标准体系是保障我国国门生物安全的重要措施,是实施植物检疫的基础。植物病原细菌作为植物有害生物的重要成员,严重威胁着我国农业生产安全,本文系统梳理了我国现行有效的进境植物检疫性细菌检疫鉴定相关标准,探讨了我国检疫性细菌检疫鉴定技术标准化现状及存在的问题,并提出了相关建议,以期为进一步开展检疫性细菌检疫鉴定标准化工作提供参考。

转基因抗虫作物鉴定质粒标准分子的构建与应用

苏云金芽胞杆菌基因是转基因抗虫作物中通用的外源功能基因,在绝大多数抗虫转基因作物中均有存在,然而Bt基因检测标准样品的缺乏却限制了我国转Bt基因抗虫作物检测工作的发展。为了弥补传统基体标准样品的缺失,首先将Cry1Ab、Cry1Ac、Cry3A 3种常用Bt外源基因克隆到pUC57质粒上,通过测序、酶切和qPCR等技术对质粒的序列和扩增功能进行了验证,然后对扩增效率和实际应用情况加以测试,评价其转基因检测的适用性,构建了质粒标准分子。结果显示,制备的质粒标准分子测序结果与靶标序列完全符合,酶切结果、qPCR扩增结果和扩增效率等均符合预期,在Cry1Ab、Cry1Ac、Cry3A基因特异性检测中的应用符合阳性对照要求,表明制备的阳性质粒标准分子能够作为转Cry1Ab、Cry1Ac、Cry3A基因qPCR基因特异性检测的阳性标准样品。

常见布尼亚病毒病诊断研究进展

布尼亚病毒目下属多个病毒科(属)的病毒对人和动物具有烈性感染致病能力或潜在的感染致病风险。本文以常见的感染动物和人兽共患的布尼亚病毒为重点,介绍了卡奇谷病、赤羽病、施马伦贝格病、绵羊内罗毕病、克里米亚-刚果出血热和裂谷热的临床诊断和实验室检测方法,对布尼亚病毒感染引起的市场生物安全防控工作具有重要意义。

一种改进的水稻总DNA的快速提取方法

植物总DNA的提取质量是植物分子生物学操作成败的关键 ,一个优秀的总DNA提取方法往往可以达到事半功倍的效果。本文以水稻叶片为材料 ,提出了一种改进的植物叶片总DNA快速提取方法 ,该方法能在 35min之内提取到水稻总DNA。电泳结果表明此改进方法提取的总DNA产量与传统CTAB法相当 ,PCR扩增结果表明其质量可靠 。

有害生物风险分析研究工作的发展

本文认为有害生物传入可能性研究、有害生物适生性研究、有害生物综合风险评估和风险管理研究是有害生物风险分析(PRA)的3个发展阶段。提出强化PRA基础理论研究、着力定量分析方法研究和开展风险管理措施的效能研究是中国现阶段PRA的研究领域。