我国几种植物植原体的快速分子鉴别与鉴定的研究

选用桑萎缩病(M u lberry dw arf,MD)、枣疯病(Ju jube w itches-broom,JW B)、酸枣丛枝病(W ild ju jube w itches-broom,W JW B)、泡桐丛枝病(Pau lownia w itches-broom,PaW B)和苦楝丛枝病(Chinaberry tree w itches-broom,CW B)5种不同植物植原体和来源于3个不同地区PaW B和JW B材料进行16S rDNA和23S rDNA PCR扩增、异源双链迁移率分析(HMA)、PCR产物的RFLP分析和16S rDNA的克隆和测序等比较研究,建立了一种快速确定未知植原体种类和分类地位的分子鉴别与鉴定优化程序;并可对田间采集的各种植物植原体样品进行快速鉴定和鉴别。16S rDNA PCR产物HMA分析结果显示,JW B与CW B、MD和PaW B皆可形成明显的异源杂交双链;而CW B、MD和PaW B植原体之间未能形成异源双链。JW B和PaW B不同地区样品之间、JW B和W JW B之间也未发现异源杂交双链的形成。而23S rDNA PCR产物HMA分析则可以将MD与PaW B区分开。进一步对未知分类地位的CW B序列测定及与其它植原体16S rDNA的RFLP和同源性比较结果显示,CW B与PaW B同源性为99.5%,其中与MD的同源性高达99.7%,因而应将CW B归为翠菊黄花组16S r I-B,16S r I-B(rp-B)。

烟草环斑病毒的定量检测技术研究

目的:建立特异、灵敏、快速的TaqMam实时荧光定量PCR方法,用于烟草环斑病毒(TRSV)的定量检测。方法:用纳米磁珠法提取病毒RNA,构建包含烟草环斑病毒全CP序列的质粒标准品。根据CP保守序列设计特异性的引物和TaqMam荧光探针,构建标准曲线,建立TRSV的实时荧光绝对定量PCR方法,并对该方法的特异性、灵敏度和重复性进行评估。结果:建立的方法特异性好,与南芥菜花叶病毒、马铃薯X病毒和马铃薯Y病毒均无交叉反应;至少能检测到767个病毒拷贝,灵敏度比普通PCR高100倍;同一样品试验内及试验间重复性实验的变异系数均小于3%,重复性好;检测结果准确可靠,构建的标准曲线有较好的线性关系(R2=0.997)。结论:建立的TRSV TaqMan实时荧光定量PCR检测方法可满足口岸高通量、快速、准确的检验检疫要求。