尼罗罗非鱼3种Siglecslike融合蛋白在COS-7细胞中的表达及其结合活性的初步研究

为获得尼罗罗非鱼Siglecs like融合蛋白,开展相关Siglecs like蛋白的功能研究,深入了解罗非鱼与无乳链球菌相互作用机制。本研究利用前期构建的3个含Siglecs like ORF的克隆质粒,PCR扩增获得Siglec-1、Siglec-4b和Siglec-14 like的膜外段序列,插入真核表达载体pc DNA3.1(+)h Ig G1 Fc中,双酶切、测序鉴定后转染COS-7细胞。q PCR、Western-blot对目的蛋白的表达进行检测;亲和层析法纯化融合蛋白,SDS-PAGE电泳检测纯化效率。ELISA检测融合蛋白与GBS的结合活性。测序结果显示,成功构建3个融合蛋白真核表达载体pc DNA3.1(+)h Ig G1 Fc-Siglecs like/Ex。检测结果显示,转染细胞中3个Siglecs/Ex-Fc融合蛋白在mRNA和蛋白水平都有高效表达,且过柱后的融合蛋白具有较高纯度;3个融合蛋白与罗非鱼源GBS的结合活性较对照组均有显著差异。研究表明,利用真核表达系统成功制备了具有较高纯度的尼罗罗非鱼3种Siglecs融合蛋白,且均有与GBS的结合活性。

草鱼养殖池塘生物膜固着微生物群落碳代谢Biolog分析

为了探索池塘生态系统中生物膜形成过程固着微生物对碳源的需求特征,以生态基为生物膜载体材料,以草鱼养殖池塘为生物膜培养环境,利用Biolog技术,分析了生物膜形成过程中（第0、15、30、45和60天）微生物群落碳代谢特征。结果表明,不同采样时间生物膜固着微生物样品平均颜色变化率（average well color development,AWCD）均在培养168 h后达到稳定,并且5个采样时间点的AWCD值即对单一碳源的利用能力存在显著差异,生物膜固着微生物的碳代谢能力在15、30、45 d时最强,显著高于0和60 d（P〈0.05）;多样性指数也呈现出与AWCD值相同的规律,15、30和45 d生态基的4类多样性指数（Shannon指数、Pielou指数、Mc Intosh指数和丰富度指数）均显著高于0和60 d（P〈0.05）;同一采样时间生物膜固着微生物对多聚物类和碳水化合物类的利用率明显高于胺类、氨基酸类、酚类和羧酸类;随着生物膜的形成,固着微生物提高了对α-D-葡萄糖-1-磷酸、L-丝氨酸、N-乙酰-D-葡萄糖氨、吐温40、D-甘露醇等碳源的利用率;生物膜微生物代谢特征PCA分析表明,主成分1（PC1）贡献度为33.9%,主成分2（PC2）贡献度为21.1%,15、30和45 d的固着微生物群落差异较小,碳源代谢差异不显著,而与0和60 d的碳代谢差异显著。池塘生态系统中生物膜固着微生物在15~45 d代谢能力最强,且对碳源的利用是有选择性的。

低温对罗非鱼基因组DNA甲基化的影响

以经过连续多代抗寒选育获得的尼罗罗非鱼耐寒品系为实验材料,采用DNA甲基化敏感扩增多态性(methylation sensitive amplified polymorphism,MSAP)分析方法从全基因组水平上探讨了低温适应对罗非鱼DNA序列中CCGG位点的甲基化水平的影响。结果显示,选用的18对选择性扩增引物共检测到849个位点。耐寒品系检测到的位点数为411个,对照组为438个,其中发生甲基化的位点数分别为72和104个,总甲基化率分别为17.52%和23.74%;全甲基化位点分别为37个和65个,全甲基化率分别为9.00%和14.84%;半甲基化位点分别为35个和39个,半甲基化率分别为8.52%和8.90%。结果分析表明,尼罗罗非鱼耐寒品系的总甲基化水平、全甲基化水平和半甲基化水平较对照组均有一定程度的下降。与对照组相比,尼罗罗非鱼耐寒品系基因组DNA甲基化总体水平下降了6.22%,其中以全甲基化位点变异为主,其下降幅度比例明显,为5.84%。由此可见,经过连续多代的低温胁迫可导致尼罗罗非鱼DNA甲基化水平发生改变,发生了去甲基化反应,表现为基因组甲基化程度降低的特征,说明了DNA甲基化与罗非鱼抗寒性反应密切相关。

摄食不同饵料草鱼肠道菌群PCR-DGGE指纹图谱构建及分子鉴定

采用免培养的16S rDNA梯度凝胶电泳技术(DGGE)对摄食不同饵料(非膨化饲料组、膨化饲料组和蚕豆组)的草鱼肠道内容物细菌分析建立指纹图谱,并对主要优势条带进行了切胶克隆和测序。PCR-DGGE指纹图谱初步分析发现,非膨化饲料组、膨化饲料组和蚕豆组分别产生了19条、16条和15条可以鉴别的条带,且均有2-3条优势菌条带;非膨化饲料组样品和蚕豆组样品的DGGE指纹图谱的相似性系数为53.6%,非膨化饲料组菌群和膨化饲料组的相似性为39.4%。对PCR-DGGE指纹图谱主要条带进一步回收、克隆和测序,结果共得到25条序列,将所得到的序列在NCBI数据库中同源性分析,发现草鱼肠道内容物细菌群落主要为弧菌科、肠杆菌科和气单胞菌属细菌,其中包括14条不可培养细菌。

2个尼罗罗非鱼群体GHSR基因5＇侧翼序列的多态性及其遗传多样性分析

该试验以快长尼罗罗非鱼(Oreochromis niloticus)和普通尼罗罗非鱼2个群体为研究对象,通过PCR扩增与测序,获得GHSR基因5'侧翼区序列77条,片段大小为1 217 bp。共检测出变异位点57个,包括12个插入/缺失位点和45个多态性位点。共发现16种单倍型,其中Hap2可能为原始单倍型。16种单倍型在进化树中聚为A和B 2支,A支中有11种单倍型,在普通群体和快长群体中均有分布,但快长群体中所占比例较高;B支中有5种单倍型,均分布于普通群体中。遗传多样性参数显示普通尼罗罗非鱼群体的核苷酸多样性(Pi)、单倍型多样性(Hd)和平均核苷酸差异数(K)都高于快长尼罗罗非鱼群体。AMOVA分析结果显示快长和普通尼罗罗非鱼2个群体之间的Fst为-0.200 0(P>0.1),表明2个群体间遗传分化不明显,且2个群体的遗传差异主要来自群体内(120%)。

美丽硬仆骨舌鱼mtDNA D-loop区遗传变异特征

采用直接测序法分析美丽硬仆骨舌鱼(Scleropages formosus)3个种群(金龙鱼、红龙鱼和青龙鱼)共24个个体的线粒体D-loop区的遗传变异特征。经序列比对、分析,金龙鱼、红龙鱼和青龙鱼的D-loop序列不仅在个体间存在位点序列的变异(17个简约性信息位点),而且还存在序列长度的多态性(长度为915-924 bp),这种长度的差异在于存在不同碱基长度的微卫星序列。3种龙鱼碱基组成基本一致,G含量偏低。定义了10种单倍型,但金龙鱼、红龙鱼和青龙鱼间没有共享单倍型,单倍型多样度较高(0.667-1.00),核苷酸多样度较低(0.001 09-0.003 23)。AMOVA分析显示,变异主要来自地理区内不同群体间,个体间遗传距离为0-0.008 7,显示遗传变异仍处于种内水平。NJ、MP和Bayesian构建的分子系统树拓扑结构基本一致,但不能有效地反映金龙鱼、红龙鱼和青龙鱼间的亲缘关系。

大口黑鲈NPY基因多态性及与生长的关联分析

神经肽Y （NPY）是鱼类摄食调控网络中具有促进食欲的摄食因子,NPY基因上的多态性可能影响鱼类的摄食进而对生长性状产生影响。本研究通过PCR扩增和直接测序在大口黑鲈NPY基因5＇非编码区筛选获得1个SNP位点S1 （A-85C）。随机选取同塘饲养的12月龄大口黑鲈327尾作为分型群体,采用SNaPshot方法检测每尾鱼中S1位点的基因型,运用Popgene 32软件进行群体遗传结构分析。结果表明,S1位点共有3种基因型：AA、AC和CC,其分布频率分别为0.560、0.416和0.024。该位点在群体中的有效等位基因数（Ne）、观测杂合度（Ho）和期望杂合度（He）分别为1.928、0.450和0.449,处于哈温平衡。采用一般线性模型分析不同基因型与大口黑鲈生长性状之间的相关性,结果显示：AC基因型群体的平均体质量、体宽、全长和体高分别高于AA基因型群体和CC基因型群体,其中AC基因型个体的平均体质量比CC基因型个体的平均体质量增加了15.37%,但在统计上均没有达到显著相关（p〉0.05）。这可能与CC基因型个体明显偏少,只占分型群体的2.4%有关。