基因Ⅱ型草鱼呼肠孤病毒TaqMan荧光定量PCR检测方法的建立与应用

基因Ⅱ型草鱼呼肠孤病毒(GCRV-Ⅱ)是当前引起草鱼出血病暴发与流行的主要病原,为建立快速检测GCRV-Ⅱ的方法,本研究根据GCRV-ⅡRd Rp基因的保守区域序列设计引物及TaqMan探针,经反应参数优化,建立了检测GCRV-Ⅱ的荧光定量PCR方法。结果显示,该方法仅对GCRV-Ⅱ的靶基因序列进行扩增,与其它非靶目标核酸均无交叉反应;其最低检出量为3拷贝/μL病毒核酸,比普通PCR的敏感度高100倍;组内和组间重复试验变异系数均小于1%。采用该方法检测60份草鱼出血病疑似样品,GCRV-Ⅱ阳性检出率为75%(45/60),与细胞分离结果一致。应用该方法分析了GCRV-Ⅱ在不同细胞和不同培养方式下病毒的增殖含量,结果显示GSB和PSF细胞增殖量最大,达106拷贝/μL^107拷贝/μL病毒核酸,转瓶接种比常规的细胞培养瓶和培养板接种其病毒含量低2个数量级。本研究建立的GCRV-ⅡTaqMan荧光定量PCR方法具有高效、特异、敏感、可重复性强的优点,适用于GCRV-Ⅱ的临床快速检测和病毒定量分析。