水产动物口服疫苗的研究进展

疫苗的使用能够有效地提高水产动物对水产常见疾病的抵抗力,减少疾病的发生与传染,减少化学类药物的使用,降低对环境的污染程度,减少治理环境的经济损失。其中注射疫苗费时费力,易损伤鱼体;浸泡疫苗需要量大,易产生强应激反应;而口服疫苗能够适用于各种体型的鱼类,避免了注射和浸泡两种接种方式存在的问题,是较为理想的免疫方式。目前水产口服疫苗中,聚合微球体和生物被膜制备的佐剂疫苗可使抗原成分免受各种消化酶类影响而被广泛应用,但在实际生产中的使用成本较高。通过非致病性的微生物如细菌等来表达疫苗中的抗原成分,制备而成的生物载体疫苗,使用成本低,免疫效果好,但安全性评价周期长,大规模批量化生产有难度。综述了几种主要的水产口服疫苗的现状和关键技术,在未来的工作中应重点解决疫苗安全性、临床适用性等问题,研制出生产成本低、免疫效果好的口服疫苗。

渔用疫苗佐剂的研究进展

目前,我国水产养殖业已进入规模化、产业化模式,在水产动物疾病的困扰下,免疫防控是抵抗传染性疾病的有效方式之一。弱毒疫苗存在毒力返强的风险,传统的灭活疫苗和新兴的重组疫苗存在抗原量大、免疫持续期短、免疫效力低的问题,单独使用时不能达到理想的免疫效果。佐剂是一种先于抗原或与抗原同时使用的物质,可增强非特异性免疫反应,仅使用少量抗原即能达到理想的免疫效果,配比合适的疫苗佐剂可有效提高疫苗的保护力。本文就目前常见的渔用疫苗佐剂作一综述,为佐剂疫苗的研发提供参考。

鲤疱疹病毒3型研究进展

鲤疱疹病毒3型(Cyprinid herpesvirus 3,CyHV-3)是引起高度传染性锦鲤疱疹病毒病(Koi herpesvirus disease,KHVD)的病原,该病毒自1997年首次报道以来,在全球多个国家传播、流行,范围覆盖亚洲、欧洲、北美及非洲多个国家,给鲤鱼及锦鲤养殖业造成无可估量的经济损失。本文就鲤疱疹病毒3型的病原学、流行病学、感染机制、诊断及防控等方面的研究进行简要综述,以期为鲤疱疹病毒3型基础研究和疾病防控策略的建立提供参考信息。

锦鲤疱疹病毒GZ1301株的分离与鉴定

2013年4月,广东省一锦鲤养殖场暴发不明病因疾病,濒死锦鲤在塘边游动缓慢直至死亡,死亡率高达100%。现场采样发现,发病锦鲤体长25 cm,眼球凹陷,胸鳍及腹鳍出现出血斑点,解剖发现内脏器官包括肝、脾、肾肿大。细菌分离结果显示,内脏器官肝脏和肾脏中未分离到细菌。提取自然发病鱼的肝、脾、肾、鳃组织DNA作为模板,采用世界动物卫生组织(OIE)推荐的锦鲤疱疹病毒(KHV)检测引物进行PCR扩增,均能扩增出预期大小的特异性产物。NCBI的Blast搜索结果显示,扩增序列与KHV胸苷激酶(thymidine kinase,TK)基因核苷酸序列同源性为99%。病鱼内脏组织研磨过滤除菌后,腹腔注射20尾锦鲤,可复制出与自然发病相似的症状,并于7 d内全部死亡。取病鱼的鳃和肾脏研磨过滤除菌后进行细胞感染实验,结果显示,组织滤液感染CCB细胞后,盲传5代可以观察到典型的细胞病变效应(CPE)。将出现典型CPE的CCB细胞进行超薄切片制备和电镜观察,电镜下病毒呈对称20面体,直径约100 nm。将出现典型CPE的细胞进行间接免疫荧光实验,可以观察到特异性荧光。根据TK基因全长序列建立系统进化树,证实该毒株为KHV亚洲型毒株,暂命名为KHV-GZ1301株。研究结果可为KHV起源进化、分类以及疾病防控提供重要材料。

基因Ⅰ型草鱼呼肠孤病毒TaqMan Real-Time PCR检测方法的建立及应用

为了建立和应用可检测基因I型草鱼呼肠孤病毒（GCRV）的荧光定量检测方法，实验根据基因I型GCRV的s6保守序列，分别设计扩增目的条带661bp普通引物（P1、P2）、扩增目的条带159bp荧光定量引物（F1、F2）和一条探针；同时构建含有目的片段的PVAX1-S6作为标准质粒，10倍梯度稀释构建质粒拷贝数与Ct值的标准曲线（Y=-3．389X＋38．076）。结果表明，此方法在3．9×10^7～3．9×10^1拷贝／uL之间相关性较好，R2为0．992，最小检测量为4拷贝／uL；且与基因Ⅱ型、Ⅲ型GCRV以及其他病原核酸无交叉反应。运用该方法检测16份草鱼出血病疑似样品，阳性结果为4份；而普通PCR检测仅2份显示阳性。本研究建立了针对基因I型GCRV的荧光定量检测方法，具有高效、特异、灵敏、可重复性强的优点，适合于目前基因I型GCRV的临床快速检测和病毒定量分析。

鲤疱疹病毒3型焦磷酸测序检测方法的建立

为了针对鲤疱疹病毒3型(Cyprinid herpesvirus 3,Cy HV-3)建立一种基于焦磷酸测序技术的高通量、自动化、快速的检测方法,根据Cy HV-3 ORF55、ORF79和ORF92基因保守区域设计特异性PCR扩增引物和测序引物,进行PCR扩增筛选扩增效率最高的引物。PCR灵敏性和特异性试验结果显示,针对ORF79设计的引物扩增效率最高,最低检测量为100个拷贝数,且能特异性识别Cy HV-3;将PCR产物进行焦磷酸测序,获得的序列经BLAST比对显示与Cy HV-3-U、I、J和GZ11分离株一致性均为100%。该检测方法方便快速,适用于出入境口岸大批量样品Cy HV-3诊断检测。

单壁碳纳米管载锦鲤疱疹病毒ORF149核酸疫苗的构建

为了开发新型高效疫苗预防锦鲤疱疹病毒病,以单壁碳纳米管(SWCNT)作为运输载体,构建锦鲤疱疹病毒(KHV)ORF149核酸疫苗。首先构建pcDNA3.1(+)-ORF149重组质粒,通过瞬时转染和免疫印迹分析确定其表达情况,然后通过1,3-偶极环加成反应法将重组质粒与SWCNTs进行偶联,最后通过扫描电镜观察和核酸电泳鉴定其偶联是否成功。结果表明,构建的重组质粒转染细胞后经免疫印迹分析和间接免疫荧光试验均能检测到特异性信号;在核酸琼脂糖凝胶电泳中,构建的重组疫苗电泳条带消失;在场发射扫描电镜观察下,与重组质粒进行偶联的SWCNTs和空白SWCNTs形态差异明显。

锦鲤疱疹病毒保存方法的筛选及比较

目的筛选并比较锦鲤疱疹病毒(Koi herpesvirus,KHV)的保存方法。方法将患锦鲤疱疹病毒病(Koi herpesvirus disease,KHVD)的患病鱼组织分别采用-80℃超低温保存法、液氮超低温保存法、50%磷酸甘油缓冲液保存法、乙醇保存法及异丙醇保存法保存90 d,进行PCR鉴定,同时检测不同方法保存的患病组织对感染健康鱼及CCB细胞的影响。用KHV感染CCB细胞后,收集病毒液,分别于4、-20、-80℃及液氮中存放90 d,检测病毒感染力(TCID50)。结果 5种方法保存的患病鱼组织经PCR检测均为KHV阳性。于50%磷酸甘油缓冲液、乙醇及异丙醇中保存的患病鱼组织失去了感染健康鱼的能力,而于-80℃及液氮中保存的患病鱼组织均可使健康锦鲤感染KHV;仅保存于50%磷酸甘油缓冲液中的患病鱼组织可感染CCB细胞。于4及-20℃保存的CCB细胞病毒液的病毒感染力分别下降61%和50%,而于-80℃及液氮中保存的CCB细胞病毒液的病毒感染力仅下降7%。结论利用-80℃及液氮超低温保存法可长期保存患病组织病料和细胞病毒液,于50%磷酸甘油缓冲液保存的组织病料有利于进行病毒的细胞分离。