青藏高原淡水鱼类的研究现状

青藏高原地区海拔高、水温低、水流急,大陆性气候强,水中含氧量低,有丰富的山区冷水性耐低氧的底层鱼类。该地区的鱼类区系、地理分布、独有的生理特性及其成因与自然环境的演变有深刻的、密切的关系。简要综述了近70年来各国学者对青藏高原地区在鱼类区系、鱼类地理、新物种发现、解剖学、细胞学、遗传学、鱼病学、分子生物学以及经济生长性能等方面的研究现状。

人工条件下日本鳗鲡胚胎及早期仔鱼发育的生物学特征

在多年对日本鳗鲡人工育苗技术研究的基础上,通过采用对胚胎和早期仔鱼的活体观察、计算机图文分析以及组织切片等方法,系统研究了鳗鲡胚胎及孵化后19d前仔鱼的生物学特性。研究结果表明,在水温(23±0.5)℃条件下,日本鳗鲡从受精卵到仔鱼出膜需约38h30min,总积温为885.50℃·h。其特征与一般硬骨鱼类胚胎发育基本相同,鳗鲡胚胎发育可分为14期,为典型的盘状卵裂,原肠作用通过细胞的下包和内卷完成。但日本鳗鲡早期仔鱼与一般硬骨鱼类的仔鱼存在较大差异,表现为无色透明的血细胞和S形心管;开放型的口腔,发达且不能闭合的上下颌和3对颌齿;孵化后3～9d在身体两侧出现由神经细胞和支持细胞构成发达的感觉丘,其数目为6～9对不等;以及形态不断变化的尾垂体等生物学特性。分析认为这些生物学特性决定了日本鳗鲡仔鱼的孵化环境可能相对较稳定,以及仔鱼摄食方式可能为触碰后咬食的方式。

日本鳗鲡雌鳗卵巢发育期间肌肉脂肪酸的组成及消耗

研究采用3种不同的处理方式(I&GD、I&nGD和A&nGD)对雌鳗处理后,进行了生物学相关参数、肌肉脂肪酸组成和含量变化测定分析。研究结果表明,日本鳗鲡在性腺发育期间,体重一直呈一个下降的趋势,直到产卵前,才显著高于野生海鳗。该现象被称为水合反应。实验结束时,3个实验组的脂肪总量均有不同程度的下降,其中,I&GD组下降最多,占总脂肪的66.55%;其次是A&nGD组,占总脂肪的43.76%;下降最少的是I&nGD组,占总脂肪的34.68%。研究对日本鳗鲡的肌肉共测出了17种脂肪酸,SFA 7种、MUFA 2种、PUFA 8种。其中,MUFA虽然只有2种,但在脂肪酸总量中占的百分比却较高达38.02%,而且它们的消耗与性腺发育和基础代谢有关,与雌鳗的游泳耗能无关。在8种PUFA中,AA的变化很特殊。实验期间,它在日本鳗鲡肌肉内是一个积累和消耗的动态过程。而且,积累程度与雌鳗的游动有关,游动越多,积累越多。EPA虽然能被检出,但量很低,而且各组间的变化无明显规律。DHA在日本鳗鲡肌肉中的含量达到123.91 mg/g干肌肉,占总脂肪的32.52%。卵巢发育所消耗的量也很多,I&GD组在卵巢发育结束后,下降到10.59 mg/g干肌肉。相关性分析发现,虽然总脂肪酸、PUFA、DHA和EPA与GSI间均存在一定程度的负相关性,但关系最密切的是DHA,其r=-0.952(P<0.01,n=5),关系最小的是EPA,其r=-0.882(P<0.05,n=5)。因此分析认为DHA是日本鳗鲡性腺发育所需的最主要的一种脂肪酸。对能量分布进行综合分析后认为,日本鳗鲡在人工诱导性腺发育期间,基础代谢所需的脂肪量(LBM)占总脂肪量的34.68%,性腺发育所需脂肪量(LGD)占总脂肪量的32.49%,运动耗能所需脂肪量(LM)占总脂肪量的9.79%。因此认为,日本鳗鲡在不摄食的情况下,肌肉中的脂肪不仅能提供性腺发育所需的营养物质,而且还能满足洄游2000海里到达产卵场所需的能量。

计算机辅助对几种鲟鱼冻精激活液的比较

首次在我国采用鱼类彩色精子图文分析系统(FSQAS-2000)对中华鲟、史氏鲟、西伯利亚鲟和匙吻鲟经超低温冷冻保存后的精子,在不同激活液条件下,平均曲线运动速度(VCL)、平均直线运动速度(VSL)、平均路径运动速度(VAP)、平均移动角度(MAD)、以及冷冻前后精子活率的变化等多项参数进行了统计学比较研究。研究分析了不同渗透压、pH以及含Mg^(2+)的激活液对这些参数的影响。研究结果表明:几种鲟鱼激活液的渗透压均较低,其中西伯利亚鲟最低,为10 mOsm·kg^(-1);中华鲟和史氏鲟为20 mOsm·kg^(-1);匙吻鲟最高,为30 mOsm·kg^(-1)。不同的渗透压对冷冻精子的VCL、VSL、VAP、以及精子活率均产生显著(P≤0.05)或极显著(P≤0.01)影响。激活液的pH除了对冷冻精子的上述参数产生影响外,最显著的是对精子的运动轨迹,即平均移动角度(MAD°·s^(-1))产生影响(P≤0.01)。pH越低,精子的MAD越小。几种鲟鱼的最适pH分别为西伯利亚鲟pH 7.5,中华鲟、史氏鲟和匙吻鲟pH 8.5。当4种鲟鱼的冷冻精子激活液中加入5 mmol·L^(-1)MgCl_2时,冷冻精子的3种运动速度显著提高(P≤0.01)。综合分析后认为:西伯利亚鲟的冷冻精子激活液应为10 mmol·L^(-1)Tris-HCl+5 mmol·L^(-1)MgCl_2,pH 7.5;中华鲟和史氏鲟的冷冻精子激活液为20 mmol·L^(-1)Tris-HCl+5 mmol·L^(-1)MgCl_2,pH 8.5;匙吻鲟的冷冻精子激活液为30 mmol·L^(-1)Tris-HCl+5 mmol·L^(-1) MgCl_2,pH 8.5。用此激活液对冷冻前后4种鲟鱼精子活力的相关性进行线性回归分析发现,西伯利亚鲟的R^2=0.8296(P<0.01);中华鲟的R^2=0.9860(P<0.01);史氏鲟的R^2= 0.9622(P<0.01);匙吻鲟R^2=0.9477(P<0.01)。说明冷冻前后4种鲟鱼精子的平均活率存在着极显著的线性正相关性。

注射T_4对日本鳗鲡血清、卵、早期幼苗甲状腺激素含量变化及对幼苗存活率的影响

对产卵前的雌鳗注射了不同剂量的甲状腺素(T4),然后利用放射性免疫法(RIA)测定了雌鳗血清、卵、胚胎及幼苗各发育时间段三碘甲腺原氨酸(T3)和甲状腺素(T4)的含量变化。结果发现,注射外源T424h后,随着雌鳗血清中的T4含量达到峰值,T3含量也达到了峰值。说明日本鳗鲡体内存在5’-单脱碘酶。与此同时,随着血清中T3和T4含量达到峰值,卵中的T3和T4含量也达到了峰值,进而证明母体中的T3和T4能够转入鳗鲡幼苗。进一步调整T4的注射剂量和时间后发现,在21℃水温条件下,T4的剂量为10～15mg·(500g)-1时,注射催产针前12h注射的效果最好。用该方法注射T4后,幼苗各发育时间段的存活率与对照组比较存在显著差异,出膜第9天的存活率由对照组的1.3%提高到22.0%。但日本鳗鲡幼苗最终未能存活,说明甲状腺素并不是影响日本鳗鲡幼苗存活的唯一因素。

外源激素及环境因子对日本鳗鲡卵巢发育的影响

开展了不同外源激素、剂量、注射针距以及环境因子对鳗鲡卵巢发育影响的研究。在所试验的外源激素中,HCG和PT对鳗鲡卵巢催熟效果较好,LHRH-A和TOP则无明显效果。外源激素注射剂量越高,卵巢发育所需时间越短,但注射刘量过低,催熟率则急剧下降。采用注射剂量为0.5mgPT+150IUHCG/500g。在外源激素总剂量不变的情况下,改变注射针距7～15d,除卵巢发育所需时间随针距而延长外,总催熟率不变。超过15d,则催熟率下降。研究认为,鳗鲡卵巢成熟所需外源激素最低总剂量为3.5～4.5mgTP+1050～1350TUHCG/500g。试验的环境因子包括温度、盐度、钙镁比以及pH,除温度高于24℃或低于14℃对卵巢发育有明显的影响外,其它因子在试验范围内对鳗鲡卵巢的发育影响不明显。

鲫血清转铁蛋白cDNA片段的克隆与序列分析

取体重约300g鲜活鲫(Carassiusauratus)的肝组织进行总RNA提取。从GenBank数据库查询已发表的8种鱼转铁蛋白cDNA或基因序列,根据铁离子结合转运功能位点,设计并合成了2对引物P1、P4以及P2、P3,克隆出鲫血清转铁蛋白cDNA中的从大约550bp至1450bp的核心片段,长度为0.9kb。同时,比较了几种鱼血清转铁蛋白cDNA序列的同源性,并推导出鲫血清转铁蛋白cDNA核心片段的氨基酸序列,并分析了该氨基酸序列的结构和特性。

鲫血清转铁蛋白cDNA克隆及系统发育进化序列分析

鱼类血清转铁蛋白是鱼类血清中一种非血红素结合铁的β-球蛋白。从GenBank数据库查询发表的鱼类转铁蛋白cDNA或基因序列,根据铁离子结合及转运功能位点,设计并合成了两对引物P1、P4以及P2、P3,克隆出鲫血清转铁蛋白cDNA中的核心片段,长度为866bp。再根据克隆出的核心片段分别设计上游及下游两对引物P5、P6以及P7、P8,随后用RACE方法分别克隆出鲫血清转铁蛋白cDNA的5'端(787bp)和3'端(1081bp)以及全长cDNA,最后在计算机上排列出鲫血清转铁蛋白全长cDNA,长度为2444bp。比较了14种鱼血清转铁蛋白cDNA序列的同源性,其同源性在30%～80%之间,结果显示鲤科鱼类(鲫、银鲫、鲤及斑马鱼等)具有很近的亲缘关系;同时进行了系统发育进化分析,证实了鱼类血清转铁蛋白进化的保守性和氨基酸序列的高度同源性。

鲫血清转铁蛋白推导序列分析及空间结构预测

用DNAClub分析软件推导出鲫血清转铁蛋白序列 ,并对该序列进行分析。推导的蛋白质长度为80 7个氨基酸 ,MW约为 90kD。其中半胱氨酸 4 3个 ,可以组成 2 1对二硫键。疏水性和二级结构几率分析表明 :有 2个非常相似的结构域分别存在于 1～ 390和 390～ 80 7区域。旋管结构和螺旋结构的分布区域 ,均分别集中在上述 2个区段中 ,同样位于 2个结构域中 ,结构也非常类似。证实了Tf由 2个同源性较高的结构域 (N结构域和C结构域 )组成。Tf的三级结构呈“V”字形 ,每个结构域又各自分为 3个小的结构小区 (即N1、N2 、N3和C1、C2 、C3 )。 2个糖基位于N1和C1区 ,呈“Y”字型结构 ;铁链位于N2 和C2 区 ;受体结合位点R1和R2 位于N3 和C3 区。

鲫血清转铁蛋白推导序列分析及空间结构预测

用DNAClub分析软件推导出鲫血清转铁蛋白序列,并对该序列进行分析。推导的蛋白质长度为807个氨基酸残基,MW约为90000。其中半胱氨酸43个,可以组成21对二硫键。疏水性和二级结构几率分析表明:有两个非常相似的结构域分别存在于1-390和390-807区域。旋管结构和螺旋结构的分布区域,均分别集中在上述两个区段中,同样位于两个结构域中,结构也非常类似。证实了转铁蛋白(Tf)由2个同源性较高的结构域(N结构域和C结构域)组成。Tf的三级结构呈"V"字形,每个结构域又各自分为3个小的结构小区(即N1、N2、N3和C1、C2、C3)。两个糖基位于N1和C1区,呈"Y"字型结构;铁链位于N2和C2区;受体结合位点R1和R2位于N3和C3区。