高效液相色谱法测定南极磷虾及其制品中虾青素的含量

目的建立一种准确测定南极磷虾及其制品中虾青素含量的高效液相色谱方法。方法样品经无水MgSO_4去除水分,以丙酮提取目标物,200 mg N-丙基乙二胺(PSA)填料分散固相萃取净化,经0.02 mol/L氢氧化钠甲醇溶液皂化12~16 h后,经YMC-Carotenoid C30色谱柱分离,经甲醇、叔丁基甲基醚和1%磷酸水溶液的流动相进行梯度洗脱,紫外检测器测定。结果南极磷虾和南极磷虾粉中虾青素的定量限分别为2.5 mg/kg和5 mg/kg;在0.1~10 mg/L时,全反式虾青素的线性关系良好(r^2>0.999);该方法的加标回收率在77.9%~91.3%之间,相对标准偏差为3.42%~8.75%。不同磷虾粉产品中虾青素的含量差异很大。结论本方法操作简便、准确,适用于南极磷虾及其制品中虾青素含量的分析。

高效液相色谱法测定虫草胶囊中腺苷的含量

目的建立高效液相色谱法(high performance liquid chromatography,HPLC)测定虫草胶囊中腺苷的含量。方法样品经过研碎、超声处理、离心、过滤后上机待测。使用岛津VP-ODS(250 mm×4.6 mm,5μm)色谱柱,以甲醇-0.04 mol/L磷酸二氢钾(15:85,V:V)为流动相;流速:1.0 m L/min;进样量:10μL;检测波长为262 nm。结果腺苷在0.7~70μg/m L的范围内呈良好线性关系,r=0.9999,回收率为99.1%~99.5%,相对标准偏差为0.2%~0.6%。结论本研究建立的方法简便、快捷、准确,可准确测定虫草胶囊中腺苷的含量。

几种主要养殖淡水、海水经济鱼类肌肉营养组成及对比分析

采用国家标准方法对我国常见几种养殖鱼类肉中的水分、灰分、蛋白质、粗脂肪、氨基酸、脂肪酸进行测定。研究了其肌肉营养组成,对比分析了几种海水鱼和淡水鱼的营养价值区别,为常见鱼类的加工利用提供基础资料。结果表明：草鱼中肌肉中蛋白质和灰分含量最高;大黄鱼的水分含量最低,粗脂肪含量最高。就氨基酸总量言（干重计）,淡水鱼略高于海水鱼,淡水鱼为72.2%-77.6%;海水鱼为51.5%-69.0%。6种鱼的必需氨基酸与总氨基酸的比值（WEAA/WTAA）为42.4%-43.7%,必需氨基酸与非必需氨基酸的比值（WEAA/WNEAA）为90.9%-94.6%。6种鱼的第一限制性氨基酸都是Met＋Cys,大菱鲆的EEAI值最高,达90.3,氨基酸营养最均衡。大黄鱼总脂肪酸种类最多,含量最高约占肌肉的10.7%;其脂肪酸中亚油酸与亚麻酸的比值（LNA：ALA）达5.9;EPA和DHA的含量最高,总和占肌肉含量的1.44%,脂肪酸营养价值最高。

基于Qbeta噬菌体装甲RNA技术的诺如病毒RNA标准参考样品的研制

目的：针对目前检测领域缺乏诺如病毒（Norovirus,No V）核酸标准样品这一瓶颈,基于Qbeta噬菌体装甲RNA技术构建内含GII型No V检测靶标RNA的病毒样颗粒（virus like particles,VLPs）标准参考样品。方法：人工合成包含Qbeta噬菌体成熟酶编码基因、衣壳蛋白编码基因、包装位点、ISO/T15216-2 2012中规定的GII型No V检测靶标对应的c DNA序列及辅助多克隆位点的DNA片段QINVGII,将其克隆到p ET-28a（＋）载体中,构建重组质粒p ET-QINVGII。将p ET-QINVGII转化大肠杆菌BL21（DE3）感受态细胞并诱导表达。表达产物经SDS-PAGE和透射电镜分析后,利用氯化铯密度梯度离心,制备纯化VLPs,并对纯化后的VLPs开展均匀性、稳定性及定值研究。结果：SDS-PAGE结果证实重组大肠杆菌在14.1k Da左右有目的条带表达;透射电镜下可观察到大量结构完整、直径约为25nm的VLPs。定值结果显示,制备的VLPs样品中GII型No V检测靶标RNA的含量为（1.06±0.06）×107copies/μl;均匀性分析结果表明样品均匀性良好,即F=2.24< F0.05 ( 9 , 20 ) ；稳定性结果表明，制备的 VLPs 在 37 ℃ 可保存 12 天、室温（ 20 ~25 ℃ ）可保存 24 天、 4 ℃ 至少可保存 90 天、-20 ℃ 至少可保存 200 天、-80 ℃ 至少可保存 300 天。结论：基于 Qbeta 噬菌体制备的 NoV 装甲 RNA 均匀性和稳定性良好，拷贝数高，为 NOV 分子检测提供了良好的标准参考样品。

鲜活贝类中单核细胞增生李斯特菌的分离鉴定及毒力基因与耐药性分析

目的研究采自产地的鲜活贝类中单核细胞增生李斯特菌(单增李斯特菌)的污染状况、毒力基因分布与耐药性。方法对采自产地的200份鲜活贝类,按照GB/T 4789.30—2010《食品安全国家标准食品卫生微生物学检验单核细胞增生李斯特氏菌检验》进行单增李斯特菌的分离与鉴定;采用Kirby-Bauer纸片扩散法测定分离株的耐药性;通过PCR法分析分离株9个毒力基因(包括prfA、plcB、hly、actA、iap、inlA、plcA、mpl、inlB)。结果在200份鲜活贝类中,共检出阳性样品4份(2.0%);有1株缺失inlB基因,1株缺失mpl基因;分离株对氨苄青霉素、庆大霉素等一线临床治疗药物敏感,但有2株对四环素和复方新诺明同时耐药,1株对复方新诺明和氧氟沙星耐药。结论采自产地的鲜活贝类存在单增李斯特菌的污染,分离株毒力基因有一定程度缺失,提示初级水产品中的单增李斯特菌污染需引起关注,并且需要继续加强食品中该菌的耐药性监测。

基于Qβ噬菌体的甲肝病毒装甲RNA标准参考样品的研制

【背景】目前食品中甲肝病毒分子的检测缺乏安全、稳定的RNA标准参考样品,影响了检测结果的科学性与准确性。【目的】基于Qβ噬菌体装甲RNA技术构建内含甲肝病毒检测靶标的装甲RNA (Hepatitis A virus armored RNA,AR-HAV),并开展初步定值、均匀性、稳定性研究,为HAV分子检测提供标准参考样品。【方法】人工合成包含Qβ噬菌体成熟酶编码基因、衣壳蛋白编码基因、包装位点、HAV检测靶标cDNA序列的核酸片段QGBHAV,并亚克隆到pET-28a(+)中构建重组质粒pET-QGBHAV,转入大肠杆菌BL21(DE3)感受态细胞进行原核表达,利用超速离心、丙烯葡聚糖凝胶层析柱纯化AR-HAV后电镜观察。通过实时荧光RT-PCR对AR-HAV进行初步定值及均匀性和稳定性研究。【结果】SDS-PAGE结果表明重组质粒在大肠杆菌中有约14.1 kD的目的蛋白表达;纯化后的AR-HAV无杂蛋白和残留质粒;电镜下可见结构完整、大小约为25nm的病毒样颗粒;定值结果显示,AR-HAV中检测靶标RNA的含量为(2.57±0.12)×107 copies/μL;均匀性分析结果为F=1.23<F0.05 (9,20),证实AR-HAV的均匀性良好;稳定性结果表明,AR-HAV在可37°C保存9 d,25°C保存25 d,4°C保存40 d,-20°C保存180 d,-80°C至少保存360 d。【结论】基于Qβ噬菌体制备的AR-HAV拷贝数高,具有良好的均匀性和稳定性,可为HAV的分子检测提供安全、稳定的标准参考样品。

基于Qβ噬菌体的A群轮状病毒装甲RNA标准参考样品的研制

目的基于Qβ噬菌体装甲RNA技术构建内含A群轮状病毒(Rotavirus,RV)检测靶标的装甲RNA(Rotavirus armored RNA,AR-RV),并开展系统的初步定值、均匀性、稳定性研究。方法人工合成核酸片段QβSNRV,该片段5'端至3'端依次为Qβ噬菌体成熟酶编码基因、衣壳蛋白编码基因、包装位点序列、RV检测靶标cDNA序列、多克隆位点序列,并将其克隆到pET-28a(+)载体中构建重组质粒pET-QβSNRV。将pET-QβSNRV转化大肠埃希菌BL21(DE3)并诱导表达,利用氯化铯密度梯度超速离心、丙烯葡聚糖凝胶层析纯化AR-RV后电镜观察,并参照GB/T 15000.3—2008《标准样品工作导则(3)标准样品定值的一般原则和统计方法》规定的方法与原则对制备的AR-RV开展定值、均匀性和稳定性研究。结果十二烷基硫酸钠-聚丙稀酰胺凝胶电泳(SDSPAGE)结果证实重组质粒在大肠埃希菌中有目的条带表达,大小约为14.1 kDa;经氯化铯密度梯度超速离心、丙烯葡聚糖凝胶层析纯化的AR-RV无杂蛋白干扰;电镜下可见结构完整的病毒样颗粒,大小约为25 nm;定值结果显示,AR-RV中检测靶标RNA的含量为(1.02±0.3)×107copies/μl;均匀性分析结果为F=0.66<F0.05(9,20),表明样品均匀性良好;稳定性结果表明,AR-RV在37℃可保存15 d、25℃可保存15 d、4℃可保存50 d、-20℃至少可保存270 d、-80℃至少可保存360 d。结论本研究基于Qβ噬菌体制备的AR-RV拷贝数高,均匀性和稳定性良好,可为RV分子检测提供安全、稳定的标准参考样品。