红鳍东方鲀养殖技术研究现状及展望

鲀红鳍东方（Takifugu rubripes），属鲀形目（Tetr-aodontiformers）、鲀亚目（Tetraodontoidei）、鲀科（Te-traodontidae）、东方鲀属（Takifugu），鲀俗称河、廷巴、腊头、龟鱼等，为近海底层食肉性鱼类，主要分布于北太平洋西部的日本、朝鲜半岛和中国沿海。因其味道鲜美、肉质细嫩，经济价值高昂，在中国北方地区和日本、韩国等形成养殖规模。

近10年鱼类细胞培养研究进展及应用展望

鱼类细胞培养作为一种重要的研究手段，广泛应用于病毒学、环境毒理学、细胞生物学、肿瘤学、基因组学、遗传学以及资源保护等方面的研究。鱼类细胞作为实验对象，有着活体鱼无法比拟的优点：（1）成本低，细胞系的维护不需要大型的养殖设备和大量的换水与充气；（2）重复性好，实验条件可以精确控制。因此，对鱼类细胞系进行深入研究，

半滑舌鳎白化现象的初步研究

通过建立半滑舌鳎家系对其白化现象进行了初步研究。实验共建立半滑舌鳎家系17个，首先对这17个家系白化率进行了抽样统计和方差分析，并对部分家系的白化个体的眼睛异常率进行了统计；其次，选取其中白化率较高的4个家系，对白化个体和正常个体的生长情况进行了对比；最后，对白化率较高的4个家系白化个体和正常个体的抗鳗弧菌病能力进行了比较。结果发现，不同家系个体白化率有较大的差别，3号家系白化率最高，高达94．50％，15号、33号和37号家系白化率为0．00％；父本为养殖群体的家系的平均白化率最高，为19．68％，父本为野生群体的家系的平均白化率最低，为3．21％，父本为选育群体的平均白化率为7．50％，但3者之间差异不显著（P〉0．05）；3个家系的白化个体眼睛异常率较高，5号家系为48．48％、10号家系为45．83％和12号家系为88．89％。选取4个家系对其白化个体和正常个体的生长情况进行比较发现，同一家系中3～4月龄白化个体在全长、体宽和体质量方面均显著或极显著小于正常个体，但生长至12～13月龄时，这种差异基本不显著，1号和17号家系白化个体的全长、体宽和体质量甚至超过了同家系的正常个体；1号和17号家系白化个体的日增重分别超过了同家系的正常个体。对选取的4个家系的白化个体和正常个体进行鳗弧菌感染实验发现，白化个体的死亡率均低于同家系正常个体，l号和17号家系的白化个体的抗病性相对同家系正常个体较突出，死亡率分别比正常个体低24．92％和20．25％。研究表明，半滑舌鳎野生群体的后代白化率较低，白化现象会伴随一定比例的眼睛异常，白化个体初期生长较慢，后期生长加快，甚至会超过正常个体，并且同一家系中白化个体的抗病性要优于正常个体。

10个半滑舌鳎家系MHC ⅡB基因多态性初步研究

为检测10个半滑舌鳎(Cynoglossus semilaevis)家系MHCⅡB(Cyse-DAB)基因的多态性水平、MHCⅡ类B位点数目以及平衡选择的作用,作者利用多聚酶链式反应(PCR)和直接测序的方法对10个半滑舌鳎家系MHCⅡB基因位点遗传变异和平衡选择进行了研究。用特异性引物和PCR扩增的半滑舌鳎MHCⅡB基因片段大约397 bp,包含一部分第一外显子,全部第一内含子和全部第二外显子。10个半滑舌鳎家系中,每家系选取5个体,每个体5个克隆序列分析发现60个不同序列,代表60个等位基因,其中有28个是新发现的,已提交到Gen Bank。同源分析表明60个等位基因相似性为89.36%。共50个个体中,有6个存在5个不同等位基因,表明在半滑舌鳎至少存在3个座位。有9个家系的MHCⅡB序列多肽结合区(PBR)的非同义替换(dN)显著高于同义替换(dS)。

脊椎动物父系基因组主动去甲基化研究进展

基因组表观遗传重组出现在细胞发育潜能发生变化的时期。早期植入前胚胎的表观遗传重新编程对于细胞分化和胚胎的生长发育是至关重要的,这涉及到表观遗传印记(尤其是DNA甲基化)的消除和重建过程。脊椎动物许多物种中,DNA复制起始前父系基因组通常要经历主动去甲基化,而母系基因组则可以保持甲基化的状态不变,直到在随后的卵裂过程中被动去甲基化。综述了脊椎动物父系基因组主动去甲基化的机制,这种去甲基化在脊椎动物各物种间的差异,以及影响这种主动去甲基化机制的因素。另外,研究外源基因表达的表观调控机制(尤其是表观遗传重编程的异常现象)有利于理解转基因克隆水产动物中普遍存在的授精成功率较低,基因整合率较低,以及胚胎发育异常等现象,有利于更好地应用转基因克隆技术。

半滑舌鳎家系建立及其生长和抗病性能测定

以半滑舌鳎渤海野生群体和人工养殖群体为基础群体,建立了半滑舌鳎家系18个。对不同家系鱼苗进行荧光标记后放在同池进行生长比较,结果表明不同家系鱼苗生长速度差异显著,筛选出生长快速的家系2个(家系15和16号),生长较快的家系4个(家系6号、7号、16号和30号),生长速度一般的家系12个(家系1号、3号、4号、10号、12号、14号、19号、24号、27号、28号、33号和34号)。利用鳗弧菌感染其中12个家系,结果显示,2号家系感染后的成活率为79.25%,被认作抗病力强家系;2个家系(12号和14号)感染后的成活率为50%～60%,被认作抗病力较强家系;6个家系(3号,6号,7号,10号,16号和19号)成活率为35%～50%,被认作抗病力一般的家系;3个家系(15号、27号和30号)的成活率在35%以下,被认作抗病力差的家系。结果表明通过家系选育方法可以筛选出生长速度快、抗病力强的半滑舌鳎优良家系,从而为半滑舌鳎高产、抗病优良品种培育提供新的技术手段。

温度对半滑舌鳎家系生长及性别的影响

以建立半滑舌鳎家系为研究材料,在受精后46 d,将家系在17.5、19.5、21.5、23.5、25.5和27.5℃6个温度梯度下培育65 d;分别在受精后64、80、103、118、129、198 d测量各温度梯度下半滑舌鳎鱼苗体长和体重,利用方差分析、Student-Newman-Keuls多重比较,分析半滑舌鳎家系鱼苗的生长规律及培育温度与体长和体重的相关性。结果显示,在以上温度范围内鱼苗的生长速度随温度的升高而加快,在198 d以后,25.5℃下鱼苗生长最快(P<0.05),21.5～23.5℃次之(P<0.05),27.5℃生长下降(P<0.05),17.5～19.5℃生长最慢(P<0.05)。在17.5～27.5℃,温度与半滑舌鳎家系生长体长、体重的Pearson系数分别为0.553和0.809,都达到极显著正相关(P<0.01)。体长、体重与温度关系式分别为L=2.460 7t0.9979(R2=0.362 8)和W=9.0×10-5t2.976(R2=0.789 5)。在198 d解剖统计各温度梯度下雌雄比例,同时固定30尾鱼苗性腺,利用光学切片法辨别并统计雌雄性别比例,对获得的性别比例进行方差分析,计算温度与性别比例的相关系数。结果显示,17.5～25.5℃下雌性率为27.04%～35.60%(P>0.05),雄性率为60.19%～71.53%(P<0.05),27.5℃雌性率为53.42%(P<0.05),雄性率为43.49%(P<0.05),温度与雌性率呈正相关(0.349),与雄性率呈负相关(-0.234)。27.5℃有利于提高半滑舌鳎家系鱼苗雌性的比例。

半滑舌鳎四倍体鱼苗的诱导与鉴定

采用静水压法处理半滑舌鳎(Cynoglossus semiliaevis)受精卵以抑制其卵裂并进行染色体加倍,筛选出有效的静水压处理起始时间、处理强度及其持续时间。结果表明,孵化水温(23±0.2)℃时,授精后21.5 min,采用40 MPa的静水压压力,休克处理4.5 min,四倍体诱导效果最好,鱼苗四倍体率达到68.3%。采用流式细胞仪分析了四倍体鱼苗细胞DNA含量,表明四倍体鱼苗细胞DNA含量为二倍体对照鱼苗的2倍。通过染色体制作分析表明四倍体鱼苗的染色体数为84条,而二倍体对照鱼苗的染色体数为42条。本研究采用静水压方法,在国内外首次建立了半滑舌鳎四倍体诱导方法。本项技术的建立旨在为大量生产半滑舌鳎三倍体不育群体奠定基础。

半滑舌鳎血淋巴细胞体外培养及其染色体制备在性别鉴定中的应用

研究建立了半滑舌鳎(Cynoglossus semilaevis Günther)外周血淋巴细胞体外培养及染色体制备方法,确定了最佳条件为:在24℃的环境中半滑舌鳎血淋巴细胞在添加20%胎牛血清的MEM培养基中,用终浓度为0.3 mg/mL的LPS为刺激源培养72h,在结束培养前3h加入终浓度0.08μg/mL秋水仙素,可获得较多、较好的染色体分裂相。利用这种方法对半滑舌鳎遗传性别进行了鉴定,同时与生理解剖观察、性腺切片、性腺细胞培养、雌性特异标记等方法进行了比较,确定了适宜各阶段不同类型鱼的性别鉴定方法,丰富了半滑舌鳎活体遗传性别鉴定的方法。

牙鲆F_1代近交系、雌核发育系的建立及遗传检测

在牙鲆育种中基于构建的大量家系,已经筛选出生长快成活率高的F1代家系0719,0750和0751,为了使其优良性状进一步纯化,采集以上3个优良家系中成熟个体的精子和卵子,分别利用家系内兄妹近交和鲈鱼冷冻精子诱导雌核发育的方式,构建了近交系3个、雌核发育系7个,在其生长至127 d和190 d时,测定体长和体重两个性状,并利用方差分析、Student-Newman-Keuls多重比较及绝对增重比较等法对两个性状进行分析,发现0751的雌核发育系较其他近交系和雌核发育系生长更快(P<0.05)。利用倍性分析仪对0751近交系和雌核发育系的染色体倍性进行分析。结果显示近交系和雌核发育系分别在G0-G1期和G2-M期DNA相对含量相近,G0-G1期DNA指数均为1.000,都具有二倍体的特点。利用筛选的14对具有多态性的微卫星引物分别对近交系和雌核发育系的遗传特征进行检测,发现近交系和雌核发育的等位基因数(Na)分别为2.214 3和2.000 0,有效等位基因数(Ne)分别为2.082 9和1.936 9,观测杂合度(Ho)分别为0.564 2和0.413 8(P<0.05),期望杂合度(He)分别为0.515 4和0.490 1,遗传杂合度(Ave_Het)分别为0.506 6和0.482 8,多态信息含量(PIC)分别为0.403和0.366,雌核发育系的遗传指数均低于近交系。除EKOP-E1-In,EKOP17-Li,EKOP-E1-Ey 3个位点仅在近交系中为高度多态,其他位点在两个系中均为中度多态。近交系和雌核发育系的遗传偏离指数(d)分别为0.091 5和-0.157 3,反映了近交系杂合子的比例远高于理论上的数值,纯合子缺失;雌核发育系杂合子缺失,纯合子比例高。利用雌核发育较近交方式更有利于基因的纯合,在牙鲆育种中具有较大的应用价值。

半滑舌鳎微卫星标记遗传连锁图谱的构建

利用全基因组测序方法筛选出微卫星标记,以渤海近海野生个体和人工养殖的半滑舌鳎(Cynoglossus semi-laevis)为亲本交配产生的F1全同胞家系为作图群体,构建了半滑舌鳎雌、雄微卫星标记遗传连锁图谱。用320对引物对父母本和92个F1个体进行遗传分析,共得到288个分离标记,其中包含112个偏分离标记(P<0.05)。其中雌性框架图包含242个标记,分布在21个连锁群上,总长度1 311.9 cM,标记间平均距离为4.9 cM,图谱覆盖率为83.3%;雄性框架图定位标记218个,21个连锁群,总长度1 316.2 cM,标记间平均距离为5.5 cM,覆盖率为82%。半滑舌鳎遗传连锁图谱的构建为半滑舌鳎重要经济性状QTL定位、分子标记辅助育种和性别控制奠定了重要基础。

沙蚕快速培育半滑舌鳎雌性亲鱼方法的研究

于2012年4月11日至2012年10月3日通过对半滑舌鳎雌性亲鱼投喂沙蚕等鲜活饵料进行强化培育后,结果发现,半滑舌鳎雌鱼生长极快,性腺发育时间提前,产卵期延长,产卵量、受精率和孵化率等显著提高,亲鱼产卵后死亡率大幅度降低。半滑舌鳎亲鱼经过4个月强化培育后,A组(实验组)平均体重由1.25 kg增至1.85 kg,净增重和日增重分别为0.6 kg和4.92 g/d,明显高于B组(对照组)的0.34 kg和2.79 g/d;截至产卵前,A组中198条亲鱼有118条性腺发育成熟,成熟率为59.60%,而B组仅有67条性腺发育成熟,成熟率为33.84%;A组性腺发育成熟的亲鱼产卵后仅有11条死亡,死亡率为9.32%,相反B组有28条亲鱼产卵后死亡,死亡比例高达41.79%,比A组高出32.47%;A组亲鱼性腺于5月26日开始发育,比B组提前了19 d,于9月10日开始产卵,比B组提前了6 d。A组产卵期为24 d,比B组延长了13d;A组亲鱼平均产卵量和平均上浮卵量分别为411.3 mL和263.2 mL,分别高出B组60.6 mL和71.2 mL,且A组平均上浮率(80.97%)明显高于B组(67.65%);A组和B组平均受精率分别为60.37%和47.29%,A组比B组高出13.08%,A组平均孵化率为53.28%,B组为22.40%,A组是B组的2.38倍。两组畸形率都较低,分别为2.36%和4.73%,但A组畸形率不足B组一半。

水温对半滑舌鳎性腺组织发育的影响

探讨了不同温度(19,21,23,25和27℃)对半滑舌鳎的性腺组织发育的影响。在受精后39～106 d对半滑舌鳎进行温度控制处理,通过石蜡组织切片,对半滑舌鳎早期性腺分化发育进行组织学观察。发现在19℃饲养条件下,受精后46 d(pfd46)半滑舌鳎性腺原始生殖细胞数量增加,有分化成卵巢的倾向;在该条件下,pfd82半滑舌鳎性腺开始分化为精巢。pfd82时,27℃条件下的幼鱼卵巢中卵原细胞数目大量增殖;精巢中精小叶多而密,结缔组织间隔清晰。pfd129时,27℃处理的幼鱼卵巢发育到Ⅱ期,其他温度处理组仍处于Ⅰ期卵巢,但随着温度的提高,卵巢中卵母细胞数目增多,且由散乱分布变为有序的排列在卵巢小叶中;精巢中贮精囊数量增多,囊腔中精子增多。pfd142时,高温处理组幼鱼性腺发育最快,其Ⅱ期卵巢中卵母细胞数目最多,精巢中后期生精细胞偏多,精子几乎分布到各个精小叶中,且贮精囊结构发达,内纳高密度精子,在周围输精管中也分布着精子。结果表明,温度影响了半滑舌鳎性腺发育程度,二者呈现线性关系,在适当温度范围内,性腺发育速度随着温度升高而加快。

牙鲆遗传连锁图谱的构建

利用基因组测序得到的大量微卫星序列,以681383B为父本、6812E36为母本杂交获得的F1为作图群体,构建了牙鲆(Paralichthys olivaceus)微卫星标记(SSR)遗传连锁图谱。雌雄图谱共定位SSR标记529个,其中雄性连锁图谱包括418个标记,分布在24个连锁群上,总长度1 418.1 cM,标记平均间隔3.62 cM,图谱覆盖率为88.7%;雌性连锁图谱包括437个标记,分布在24个连锁群上,总长度1 298.1 cM,标记平均间隔为3.16 cM,图谱覆盖率为89.1%。牙鲆中密度遗传图谱的构建为QTL分析以及分子标记辅助育种进一步奠定基础,并可以有效推动牙鲆的遗传改良工作,推动牙鲆养殖业的可持续发展。