海洋低温碱性蛋白酶亚慢性毒理学研究

应用大鼠经口、经皮肤亚慢性毒性试验 ,对海洋低温碱性蛋白酶毒理学进行研究。 12 0只Wistar大鼠 ,随机分为 6组 :对照组 ,海洋低温碱性蛋白酶 1.2 g/ kg(经口 ) ,1.2 g/ kg、0 .135g/ kg、0 .0 15g/ kg(经皮 )和 1.2 g/ kg(经皮追踪组 ) ,用药周期 90 d,追踪组增加 2 8d观察。记录和检测大鼠的一般状况和体质量增长、脏器系数、血常规、凝血时间、肝肾功、部分血液生化和离子浓度及病理检查。结果表明 ,海洋低温碱性蛋白酶各组 (经皮、经口 )大鼠的各项指标与对照组比较均未见明显异常 ( P均 >0 .0 5) ,提示大鼠能耐受长期给予 1.2 g/ kg(经皮、经口 )

黄海黄杆菌YS-9412-130低温碱性蛋白酶发酵过程动力学研究

应用自动控制发酵设备 ,对黄海黄杆菌 YS- 94 12 - 130碱性蛋白酶发酵动力学和工艺条件进行了研究。从基本的动力学概念和方程出发 ,通过分批发酵试验摸索了黄海黄杆菌 YS- 94 12 - 130生长与代谢的基本规律 ,证明了发酵过程中低温碱性蛋白酶的形成为生长部分关联型。采用补料分批培养方法限制生长基质浓度 ,确定其一系列参数值 。

海洋低温碱性蛋白酶的遗传毒理学研究

应用 NIH纯系小鼠骨髓细胞微核试验和染色体畸变试验 ,探究海洋低温碱性蛋白酶的遗传毒性作用及对人类的潜在危害。观察并计数嗜多染红细胞 ( PCE)与正红细胞 ( NRBC)的比值、微核率 ;染色体的畸变类型和畸变率 ,检测海洋低温碱性蛋白酶的诱变作用。结果表明 ,皮下注射环磷酰胺的小鼠 ,P/ N比值 <1,微核率为 2 2 .97‰ ,染色体畸变率为 18.32 % ,与生理盐水 ( NS)对照组比较差异极显著 ( P<0 .0 1) ,而海洋低温碱性蛋白酶各组小鼠微核率均 <4‰ ,染色体畸变率为 0 .19%～0 .2 5% ,与 NS组比较无显著性差异 ( P>0 .0 5)。未见海洋低温碱性蛋白酶各组对小鼠骨髓细胞的遗传毒性。

一株产低温碱性蛋白酶嗜冷海洋细菌YS-9412-130的分离和培养条件研究

自海水贝类中取样 ,经分离培养基和酪蛋白培养基复合培养 ,用检测蛋白酶产生水解圈和Folin-酚碱性蛋白酶活性测定相结合的方法从 10 0 0多份样品中初步筛到了产碱性蛋白酶活力高、性能优良的菌株 YS- 94 12 - 130。对其初步研究结果表明 ,该菌只能利用有机氮源生长 ;在接近自然海水盐度、温度 2 0℃、p H在 7.0～ 9.0条件下 。

黄海黄杆菌YS-9412-130低温碱性蛋白酶的制备工艺研究

对黄海黄杆菌所产低温碱性蛋白酶的工业生产技术和电泳纯级试剂酶的分离纯化工艺进行了实验。按照设计的中试生产技术 ,每吨发酵液可得酶粉 2 0 kg,粗酶比活大于 2 0× 10 4 U/ g;同时运用一系列纯化手段和条件 ,制备出电泳纯级试剂酶 ,纯化过程蛋白回收率在 7%左右 ,活性回收率在60 %以上 ,比活性也稳定在 1.9× 10 3U/ mg以上 ,激光灰度扫描结果试剂酶纯度大于 99% ,可以作为试剂酶满足进一步生物学研究和实际应用。其产品质量和制造工艺均达到了中试放大规模的要求。

产海洋细菌MP-2酯酶菌株的鉴定及酯酶理化性质的研究

从渤海海泥样品中分离获得1株新型酯酶菌株,经鉴定为地衣芽孢杆菌Bacillus licheniformis。所得的MP-2酯酶的最适作用温度范围50～70℃,在60℃表现出了最高活性,属于耐热酶;最适作用pH为10,属于碱性酶,其pH值作用范围比较窄;具有良好的热稳定性;金属离子Co2+,Li+对酶具有激活作用,Ca2+对酯酶的活力没有显著影响,化学试剂SDS、EDTA及Tween-20对酯酶的抑制效果显著,对常见有机溶剂具有良好的耐受力;该酯酶对碳链长短不同的底物表现出不同的酶活。

海洋低温碱性蛋白酶的急性毒性研究

应用酶工程技术 ,得到在室温下有较高酶活力的海洋低温碱性蛋白酶。为对海洋低温碱性蛋白酶进行安全性评价 ,作者应用小鼠和大鼠急性毒性试验及最大耐受量 ( MTD)测定 ,观察海洋低温碱性蛋白酶对小鼠 1次口服后产生的急性毒性反应和大鼠完整皮肤短期内接触海洋低温碱性蛋白酶所产生的毒性反应。结果表明 ,小鼠 1次口服海洋低温碱性蛋白酶的 MTD>2 0 g/kg为实际无毒物 ,其中毒的靶器官是肝脏 ,未见大鼠经皮的急性毒性反应。

海洋微生物溶菌酶的纯化与性质研究

海洋微生物溶菌酶发酵上清液经超滤、CM_SepharoseFF阳离子交换层析和SephadexG_10 0凝胶过滤层析纯化得到电泳纯的溶菌酶,纯化倍数为34 7,活力回收为2 4 1%。对纯化溶菌酶性质研究表明,该酶分子量约为39kD ,对溶壁微球菌的最适作用温度为35℃,最适作用pH为8 0 ,在5 0℃以下和pH 5 0～10 0之间都有较好的稳定性,与常见金属离子和化学试剂有良好的配伍性,广谱杀菌,对多种致病菌也有较强的溶菌作用。

海洋低温碱性蛋白酶的刺激性研究

探究海洋低温碱性蛋白酶的刺激性 ,并为其应用提供实验依据。作者应用新西兰大耳白兔 ,以 4 0 %、2 0 %和 5‰浓度的海洋低温碱性蛋白酶进行皮肤急性刺激试验 ,5‰海洋低温碱性蛋白酶的皮肤多次刺激性试验 ,1‰的海洋低温碱性蛋白酶的兔角膜刺激性试验 ,评价其安全性。结果表明 ,5‰和 2 0 %海洋碱性蛋白酶单次应用实验皮肤未出现红斑和水肿 ,对皮肤无刺激性。 4 0 %海洋低温碱性蛋白酶液对皮肤有中度刺激性。皮肤病理学显示 5‰的海洋低温碱性蛋白酶液未见皮肤的慢性刺激反应 ,皮肤结构完整、层次清晰。

海洋低温碱性蛋白酶的皮肤变态反应研究

利用酶工程技术制得的海洋低温碱性蛋白酶 ,主要用于加酶的洗涤剂 ,在室温下有较高的酶活力。为确保海洋低温碱性蛋白酶使用的安全性 ,并为其应用提供实验依据 ,本文以豚鼠为受试动物 ,进行皮肤致敏反应试验。结果表明 ,经致敏接触和激发接触 ,2 ,4 -二硝基氯苯组 ( DNCB)皮肤最大平均反应值为 3.3,致敏率为 10 0 %。海洋低温碱性蛋白酶组皮肤最大平均反应值为 0 .0 5,致敏率为5%。

海洋低温溶菌酶抗肿瘤活性的初步研究

通过观察海洋低温溶菌酶对体外培养细胞株增殖的影响、对角膜诱生血管的影响、对小鼠肉瘤 S180 (实体型 )及对小鼠肝癌 HAC(实体型 )的抑制作用 ,探讨海洋低温溶菌酶抑制肿瘤生长活性。结果表明 ,该酶与蛋清溶菌酶在抑瘤作用机制上有很大区别 ,海洋低温溶菌酶具有血管生成抑制因子的活性 。

黄海黄杆菌YS-9412-130低温碱性蛋白酶的应用研究Ⅱ.——洗涤剂用包覆型酶的配伍特性与应用效果评价

论述了洗涤剂中的低温碱性蛋白酶的物理和化学特性、去污性能及它与常规洗涤助剂的配伍性。实验结果表明 ,该包覆型酶最适反应温度为 35℃ ,p H为 10。在温度 4 0℃以下、p H5～ 11范围内均具有良好的稳定性 ,同时对低温有突出的适应性和抗氧化稳定性 ;与常规洗涤剂各成分配伍性良好 ,且低温条件下能有效地降解蛋白污渍 。

海洋侧孢短芽孢杆菌Lh-1抗菌活性物质的分离及特性研究

采用超滤、DEAE-Sephadex A25和CM-Sepharose FF离子交换层析及HPLC反相层析等步骤得到了海洋侧孢短芽孢杆菌（Brevibacillus laterosporus）Lh-1的抗菌活性物质，命名为R-1。HPLC纯化出的抗菌物质经质谱测定其分子量为1608．023Da，BIO．RAD等电聚焦测得其pI为8．55，氨基酸分析表明该物质由Leu、Tyr、val、Ile、Lys、Gly、Met、Ser、Ala9种氨基酸组成。该抗菌物质具有极强的耐热、耐酸碱特性，在pH 11．0～12．0条件下，121℃处理1h，其活力保持在75％以上。经3种蛋白酶（碱性蛋白酶、胰酶、胃蛋白酶）处理后，活性保持在80％以上。茚三酮反应阳性。推测R-1可能是低分子量的脂肽。抑菌试验表明对食品腐败菌、致病性革兰氏阴性、阳性菌及少数真菌均有抑菌活性。

海洋低温溶菌酶的制备及酶学性质

对一株海洋杆菌产低温溶菌酶的分离纯化及理化性质进行了研究。 2 0℃下将菌株在含有葡萄糖、酵母膏、胰蛋白胨的标准海水培养基中震荡培养 4 0 h。获得活性大约为 150 U/ ml的溶菌酶上清液。上清液经 SMB- 2 0生物型错流超滤系统浓缩、透析及 CM- Sepharose- FF阳离子交换层析( 2 .5cm× 2 5cm )、灌注色谱 ( 10 mm× 10 0 mm)分步纯化 ,得到电泳纯的酶。理化实验结果 ,该酶由143个氨基酸组成 ,分子量为 160 0 0 Dal,p I为 9.2 8,米氏常数 K m- 72 μg/ ml;酶对溶壁小球菌 ( Micro-coccus lysodleikticus)的最适作用 p H范围 4 .5～ 8.0 ,最适作用温度范围 5～ 50℃ ,在 5℃仍保持了55%的酶活力。该溶菌酶为典型的低温酶 ,在低温条件下还能保持较高活性 ,且广谱杀菌 ,对革兰氏阴。

黄海黄杆菌YS-9412-130低温碱性蛋白酶性质鉴定

对黄海黄杆菌 YS- 94 12 - 130菌株产低温碱性蛋白酶的理化性质研究表明 ,该酶由 2 56个氨基酸组成 ,分子量为 330 0 0 Dar,等电点 p I为 9.4 5,米氏常数 Km为 5× 10 -3 m mol/ L;酶的最适作用p H范围为 9.5～ 10 .5,最适作用温度 30℃ ,具有一定的抗氧化稳定性。Ca2 +、Mn2 对酶有激活作用 ,而 Hg2 +、Ag+对酶有抑制作用。 DFP、NBS严重抑制酶的活性 ,而同时该酶也能被 EDTA抑制。结果表明该低温碱性蛋白酶为一新型的丝氨酸蛋白酶。

产低温碱性蛋白酶黄海黄杆菌YS-9412-130的复合诱变原生质体选育

以黄海黄杆菌 YS- 94 12 - 130突变株 SW1- 10 4为出发菌 ,在原生质体形成和再生的最佳条件下制备原生质体 ,对原生质体进行复合诱变 ,对大量再生突变株进行筛选和淡水驯化 ,最终获得了高产、稳定的碱性蛋白酶产生菌 SW2 - 10 4 ,在自来水培养基中能够大量产酶 ,产酶活力为 3910 U/ ml。从而解决了黄海黄杆菌 YS- 94 12 - 130低温碱性蛋白酶大规模工业化生产设备和产业化区域的局限性。

基于改进PSO-RBFNN的海洋蛋白酶发酵过程软测量

针对海洋蛋白酶(marine protease,MP)发酵过程中某些关键参量难以在线检测,离线测量存在大滞后、易染菌的问题,提出了一种基于改进的粒子群-径向基神经网络(PSO-RBFNN)的MP发酵过程软测量建模方法。首先采用指数下降惯性权重(exponential decreasing inertia weight,EDIW)策略对粒子群算法进行改进,克服了固定惯性权重和自适应惯性权重的粒子群算法易于陷入局部极小,进化后期收敛速度慢以及全局搜索能力弱的缺点;然后,采用改进后的粒子群算法对径向基神经网络连接权值进行在线优化,确定RBFNN拓扑结构;最后,根据MP发酵过程的输入/输出向量构建RBFNN软测量模型。实验仿真结果表明,EDIW策略改进的PSO-RBFNN软测量模型训练时间缩短了40%左右,模型预测精度提高了3%以上。

黄海黄杆菌YS-9412-130产酶发酵条件的优化

以产低温碱性蛋白酶的黄海黄杆菌 YS- 94 12 - 130突变株 SW2 - 10 4为培养菌株 ,进行碳源、氮源、无机盐、起始 p H值、培养时间、接种量和接种龄等发酵条件的优化实验。实验结果证明 ,在以1%葡萄糖为碳源 ,以 3.5%豆饼粉为氮源 ,无机盐 :0 .4 % Na2 HPO4 、0 .0 3% KH2 P0 4 、0 .0 2 % Mg SO4 、0 .1% Na2 CO3、0 .2 % Ca Cl2 ,起始 p H值 7.0 ,接种 12 h种龄的种子 4 % ,2 0℃、2 50 r/ min的条件下在旋转摇床中培养 36h,菌株产酶活性最高。

黄海黄杆菌YS-9412-130固定化细胞产酶技术

3种不同的包埋材料固定化 YS- 94 12 - 130菌体细胞 ,进行半连续发酵。结果表明 ,用 2 .5%卡拉胶固定化细胞 ,产酶效率最高 ;添加明胶对产酶不利而添加豆饼粉与玉米粉后 ,酶活力有显著提高 ;卡拉胶固定化细胞发酵液中游离菌体浓度随发酵时间变化略有上升 ,总体水平较低。发酵液酶活随菌体浓度的增大而呈上升趋势 ;固定化细胞半连续发酵效率远高于游离细胞分批发酵的效率。

黄海黄杆菌YS-9412-130低温碱性蛋白酶的基因克隆和序列测定

黄海黄杆菌 YS- 94 12 - 130具有稳定的分泌低温碱性蛋白酶的能力。将其染色体 DNA用 Sau3A 部分酶切后 ,低熔点琼脂糖回收 2 - 10 Kb的 DNA片段 ,用 Klenow大片段酶半补齐 ,与用 Sal 酶切且半补齐的质粒 p UC19连接后 ,转化 E.Coli.JM10 9,构建基因文库。用酪蛋白平板法和酶联免疫吸附 ( EL ISA)的活性筛选方法从基因文库中筛选到一株产海洋低温碱性酶的阳性克隆 (命名为p HH1)。序列测定分析表明 ,此重组质粒包含有长度为 768bp低温碱性蛋白酶基因的完整的开放读码框架 ( ORF)和上游基因调控序列。此片段编码由 2 56个氨基酸组成的酶 ,计算分子量为 330 0 0 Dal。通过 Southern杂交证实了此片段来自于黄海黄杆菌 YS- 94 12 - 130基因组 DNA。