副溶血弧菌(Vibrio parahaemolyticus)tdh2基因和鳗弧菌(V.anguillarum)ompU基因二联DNA疫苗制备及其对大菱鲆(Scophthalmus maximus)免疫保护作用

采用基因工程的方法,将副溶血弧菌的热稳定直接溶血素基因tdh2和鳗弧菌外膜蛋白基因ompU进行融合,在大肠杆菌中得到表达,并利用该融合基因构建二联DNA疫苗pEGFP-N1/tdh2-ompU。用DNA疫苗按10和50μg/尾的剂量通过肌肉注射免疫大菱鲆,对大菱鲆抵抗致病性副溶血弧菌和鳗弧菌的免疫效果进行研究。结果表明,DNA疫苗免疫的大菱鲆对副溶血弧菌感染的最高保护率为100%,对鳗弧菌感染的保护率为35%。被免疫的大菱鲆肌肉组织中能检测到融合蛋白表达,在血清中能检测到较高水平特异性抗体,DNA疫苗引起的体液免疫反应水平和保护效果与注射剂量有关。

养殖活动对超微型浮游生物分布影响的研究

利用流式细胞仪对河北省扇贝养殖区微微型浮游植物、异养细菌、浮游病毒4季的丰度分布特征进行了研究,分析了三者与环境因子的相关性,并与渤海、北黄海非养殖区的超微型浮游生物丰度的分布特征进行对比。结果显示:在养殖区海域,聚球藻丰度在9.00×102—7.07×105cell/m L之间,峰值出现在秋季,且与其他季节差异显著(P<0.01)。微微型真核藻类丰度在5.80×102—3.23×105cell/m L之间,夏季赤潮暴发期间,丰度达到3.23×105cell/m L,显著高于其他季节(P<0.01)。异养细菌丰度在3.10×105—3.79×106cell/m L之间,峰值出现在秋季,夏、秋季丰度显著高于春、冬季(P<0.01)。浮游病毒丰度在2.50×105—2.17×106cell/m L之间,峰值出现在秋季,但无显著性季节差异(P>0.05)。通过主成分分析发现,聚球藻、微微型真核藻类、异养细菌和浮游病毒的丰度在不同季节受到不同环境因子的影响。在春、冬季,温度是主要影响因素;而在夏、秋季,主要受到营养盐的影响。养殖区与非养殖区超微型浮游生物主成分4季均有显著差异,养殖区异养细菌4季均是超微型浮游生物的主成分,而非养殖区超微型浮游生物的主成分4季均是微微型浮游植物,结果表明养殖活动显著影响了养殖区超微型浮游生物的群落结构和功能。

丛粒藻形态多样性与遗传多样性研究

观察了采集自不同地点的3株丛粒藻(Botryococcus braunii)(AGB-Bb01、AGB-Bb02和AGB-Bb03)的显微结构和亚显微结构,以18S rDNA和ITS区序列为目标位点比较分析了16株丛粒藻藻株的遗传距离和序列相似性,重建了系统发生树。结果表明:丛粒藻不同地理株在细胞大小、聚落大小和聚落细胞数目方面存在较明显的差异,亚显微结构显示不同藻株的杯状鞘厚度及细胞包埋程度也存在差异;不同地理株间具有较高的遗传多样性,系统发生树显示所有藻株可分成2个簇群和4个亚群,存在一定程度的地理隔离。研究证明了18S rDNA和ITS区序列是进行丛粒藻基因分型和遗传多样性研究的良好位点。本研究为系统了解丛粒藻的遗传多样性和开展优良藻株选育工作奠定了基础。

应用DGGE技术分析北黄海和青岛近海藻类DNA病毒遗传多样性

采用DGGE技术对北黄海和青岛近海藻类DNA病毒群落多样性进行调查。结果表明,在北黄海A604站、B107站和C803站分别得到10个、8个、8个OTUs,在青岛近海ZQ站得到6个OTUs,说明不同海域藻类DNA病毒多样性不同,在北黄海较丰富,青岛近海较低。北黄海3个站间相比,OTUs数量和位置均存在差异,表明同一海域不同站位藻类DNA病毒多样性也存在差异。在所得OTUs中,有2个OTUs在4个站中均存在,说明在北黄海和青岛近海存在着一些共同的藻类DNA病毒。4个站点藻类DNA病毒优势种均不相同,在A604站和ZQ仅有一个优势种,而在B107和C803各有两个优势种。

石鲽野生群体和养殖群体遗传多样性的ISSR分析

采用简单序列重复区间（ISSR）技术,对石鲽的3个野生群体——青岛群体（QD）、威海群体（WH）、莱州群体（LZ）和一个养殖群体（YZ）进行了遗传多样性研究。结果表明,从60个ISSR引物中筛选出8个ISSR引物对四个群体的基因组DNA进行扩增,共获得183个重复性好且5谱清晰的位点,4个群体的多态位点比例为48.1%-50.8%,Shannon多样性值为15.68-18.53,群体内个体间遗传相似度为0.905 3-0.918 9,群体间的遗传距离为0.005 5-0.017 3。同其他鱼类相比,石鲽群体的遗传多样性水平较低。用UPGMA方法构建的群体进化树显示,WH群体和LZ群体遗传距离最近,首先聚在一起,两者然后与YZ群体聚类,最后与QD群体相聚。利用基因分化系数进行遗传变异来源估算,结果表明石鲽群体96.47%的遗传变异来源于群体内,群体间的遗传变异仅占3.53%,不同群体间的遗传相似度较大。

条斑紫菜基因组Fosmid文库构建

高分子量基因组文库是开展条斑紫菜基因组学研究的必备工具。构建了由23 040个Fosmid克隆组成的条斑紫菜孢子体无偏倚基因组文库。检测分析表明：文库克隆重组率为100%；插入DNA片段长度为28-40 kb，平均长度为35 kb，文库覆盖率约为条斑紫菜基因组的2.78倍；从超级池中筛查条斑紫菜18S rRNA、atpA、h2A、rbcL基因，至少能得到一个阳性克隆，印证了计算所推测的文库覆盖率；随机选取6个Fosmid克隆经100代传代后插入DNA片段未发生丢失或长度变化，表明克隆传代的稳定性。该文库的构建为开展条斑紫菜基因组特性分析和基因克隆奠定了基础。

噬藻体遗传多样性的研究进展

蓝藻是一类最原始、最简单的原核藻类生物,是海洋中的主要初级生产者之一。感染蓝藻的病毒称为噬藻体。噬藻体是水生微生物群落的重要组成部分,在控制蓝藻种群动力学及调节生物生产量等方面具有重要的生态学意义。研究噬藻体的遗传多样性有助于完善噬藻体的分类,为进一步探讨噬藻体之间的进化关系、噬藻体与蓝藻之间的相互关系提供理论依据,同时为探索环境变化对噬藻体进化的影响提供新的视点。本文综述噬藻体的分类、影响噬藻体遗传多样性的因素及噬藻体遗传多样性研究常用的靶基因等方面的研究进展。

非可培养状态哈维氏弧菌(Vibrio harveyi)复苏后生理特征及毒力相关基因表达

将哈维氏弧菌SF1接种在自然海水中低温诱导进入活的非可培养状态,用添加营养物质后升温培养的方法进行复苏。用透射电镜观察不同状态哈维氏弧菌细胞形态和结构,研究哈维氏弧菌复苏后对不良环境的抵抗力,用RT-PCR检测丝氨酸蛋白酶基因Ser和rpoS基因的表达。结果表明,进入VBNC状态的哈维氏弧菌由杆状变为球状,体积比正常细胞小,复苏后恢复正常形态且对紫外辐射,热激的抵抗能力没有明显改变,对高渗透压的抵抗力减弱,而对冷激的抵抗力增强。复苏后的哈维氏弧菌对抗生素的敏感性没有改变。用RT-PCR未检测到在VBNC状态时Ser和rpoS基因的表达,而在复苏后的细胞均检测到该基因的表达,可能是其保持致病性的重要原因之一。

秦皇岛褐潮期超微型浮游生物丰度及多样性研究

秦皇岛作为中国北方重要水产养殖基地,年年爆发褐潮,对当地生态环境造成巨大影响。针对微微型真核浮游生物、浮游病毒和浮游细菌三大类群,进行了褐潮前中2个时期丰度和群落结构及其主要影响因素的分析。本研究利用流式细胞仪技术对褐潮前期和褐潮中期秦皇岛近岸海域微微型真核浮游生物、浮游细菌和浮游病毒的丰度分布特征进行了研究;利用病毒宏基因组技术、18SrDNA V9区和16SrDNA V4～V5高通量测序技术对超微型浮游生物各个类群进行多样性研究。研究发现,褐潮中期微微型真核浮游生物丰度平均值为27.50×103个/mL,浮游细菌丰度平均值为1.97×105个/mL,浮游病毒丰度平均值为9.65×105 VLP/mL。褐潮中期藻类DNA病毒含量提高（20.30%）;不等鞭毛虫门为微微型真核浮游植物主要优势类群;变形菌门为浮游细菌主要优势类群。海水生态系统中超微型浮游生物的多样性及丰度对褐潮的发生具有较高敏感性,未来,针对海洋超微型浮游生物的研究,对进一步了解褐潮机制和寻求褐潮消解方法提供了新的角度和思路。

哈维氏弧菌铁超氧化物歧化酶基因表达及免疫作用研究

哈维氏弧菌(Vibrio harveyi)是鱼虾等海水动物的重要病原菌。超氧化物歧化酶(Superoxide dismutase)通过催化超氧阴离子自由基(O2)形成O2和H2O2,以保持细胞自由基产生和清除之间的平衡,在病原菌适应环境及细菌致病性方面发挥重要作用。用PCR从哈维氏弧菌基因组扩增得到600 bp的目的片段,序列分析表明与弧菌Fe-SOD的序列相似性为91%—99%。将目的基因片段克隆到原核表达载体进行表达。SDS-PAGE电泳分析显示纯化的蛋白为单一条带,分子量为27 kD。具有典型的Fe-SOD吸收光谱,对氯仿-乙醇和H2O2敏感,表明纯化的蛋白属于Fe-SOD。用邻苯三酚自氧化法测得酶的最适pH 7,最适温度20℃。该酶在pH6—8的范围内稳定,当温度超过40℃时酶的活力迅速丧失。纯化的重组蛋白免疫大菱鲆,4周后用致病性哈维氏弧菌进行人工感染试验,对大菱鲆的免疫保护率为80.00%。Western blot可以检测到免疫大菱鲆的血清中的特异抗体。

牙鲆fibrinogen β基因的克隆及表达分析

通过mRNA差异显示发现一个鳗弧菌刺激后在牙鲆肝脏中表达量显著增加的片段,结合RACE技术得到了该差异片段1 856 bp的全长cDNA,包含一个1 479 bp的开放阅读框,编码的蛋白质含有fibrinogenβ的C末端签名序列。同源性分析表明其氨基酸序列与鱼类以及哺乳类的fibrinogenβ都具有高度的相似性,因此可断定此基因为牙鲆的fibrinogenβ基因(GenBank登录号为EF581895)。RT-PCR分析表明,在注射鳗弧菌后,该基因在肝脏、肾脏、脾脏、腮、肠、心脏中的表达量呈现逐渐增加的趋势。推测其可能在鳗弧菌侵染中,起到了促进伤口愈合的作用,或通过和其他细胞因子结合在防御细菌的侵染中发挥免疫调节作用。

ISSR标记在牙鲆(Paralichthys olivaceus)与石鲽(Kareius bicoloratus)种间杂交一代的分离方式分析

利用ISSR标记对牙鲆♀与石鲽♂单对杂交亲本及其子一代(全同胞家系)的分离方式进行了研究。结果表明,8个ISSR引物共扩增出181个标记,其中116个为多态性,占总数的64.09%;标记在F1代呈三种分离方式:符合孟德尔分离比例、偏离孟德尔分离比例和异常分离。符合孟德尔分离比例的情况包括:不分离(代表了亲本基因型的5种组合:AA×AA、AA×Aa、Aa×AA、AA×aa、aa×AA);1︰1分离(代表了亲本基因型的2种组合:Aa×aa、aa×Aa);3︰1分离(代表了亲本基因型的1种组合:Aa×Aa)。偏分离的标记包括:亲本中呈多态而在子代中偏离1︰1分离的标记和亲本均有而在子代中偏离3︰1分离的标记。异常分离的标记包括:F1代出现双亲均不具备的标记和双亲或单亲有而子代却无的标记。3种分离位点出现的频率和数量分别为:82.87%、150,11.05%、20,6.08%、11;双亲共有标记中85.33%的不发生分离,单亲特有标记中28.57%—35.85%发生正常分离,该研究结果可为进一步利用该群体构建牙鲆和石鲽遗传连锁图谱奠定良好的工作基础并提供一定的理论依据。

胶州湾微微型浮游植物丰度及其与环境因子的相关性分析

利用流式细胞仪对胶州湾微微型浮游植物4个季节的丰度分布进行了研究,并分析了微微型浮游植物与环境因子的相关性。结果表明,聚球藻的丰度在2.17×102—2.329×104个/ml之间,高值区主要分布在湾内西部和湾口海域;仅夏季、冬季丰度之间有显著性差异;夏季在垂直分布上差异显著,在B3、C4、D5连续站昼夜变化趋势基本一致,分别在13:00和3:00出现峰值。微微型真核浮游植物的丰度分布在1.028×103—8.651×104个/ml之间,主要活跃于湾内西部海域;四季丰度在垂直分布上差异不显著;春、夏季丰度明显高于秋、冬季;夏季连续站昼夜变化趋势与聚球藻基本一致。通过主成分分析表明,聚球藻和微微型真核浮游植物丰度在不同季节受不同环境因子的影响,在冬季与温度有关,温度升高,二者的丰度增高。在其它季节,二者丰度主要受营养盐等环境因子的影响。

南黄海秋季浮游病毒丰度分布及其与宿主和环境因子的相关性研究

利用流式细胞仪对南黄海秋季浮游病毒丰度在水平分布和垂直分布上的特征进行了研究,并分析了浮游病毒丰度与异养细菌、微微型浮游植物等宿主丰度以及环境因子的相关性。结果表明,该海区秋季浮游病毒丰度在(2.22×106)—(1.60×107)ind/ml之间,平均值8.32×106ind/ml。病毒丰度在调查海域的东北和中南部海域出现高值区,在西南部出现低值区,且浮游病毒丰度与异养细菌丰度的平面分布趋势较一致。在表层、中层和底层水体,浮游病毒丰度平均值分别为8.63×106、7.83×106、8.49×106ind/ml,表层和底层丰度无显著差异,但均高于中层(P<0.05)。相关性分析表明,浮游病毒丰度与异养细菌丰度、VBR呈显著正相关(P<0.01),与微微型真核浮游植物丰度呈显著负相关(P<0.05),与聚球藻、水深、水温、盐度、溶氧、叶绿素a浓度无明显相关性(P>0.05)。

渤海浮游病毒的时空分布

利用流式细胞仪对渤海浮游病毒的丰度分布进行了研究。结果表明,浮游病毒丰度在6.40×105—3.59×107个/mL之间。辽东湾断面,浮游病毒丰度春季在西部海域较高,夏季在中部海域较高,秋、冬季在东、西部海域均较高;渤海湾断面,4季丰度均在中部海域出现高值区;莱州湾断面,夏、秋、冬季均在东部海域出现丰度高值区;渤海海峡断面,春、秋、冬季于海峡中部海域丰度较高。垂直分布上,表层和底层水体浮游病毒丰度在夏季差异性显著,在其它季节无显著差异。夏季浮游病毒丰度显著高于其它季节。夏季,连续站浮游病毒丰度昼夜波动幅度较大,冬季较平缓。相关性分析表明,浮游病毒丰度在春、夏、秋季均与温度显著正相关;夏季与异养细菌丰度、微微型真核浮游植物丰度显著正相关;秋季与微微型浮游植物丰度显著正相关;冬季仅与异养细菌丰度显著正相关。

副溶血弧菌一种糖蛋白酶(复苏促进因子)在大肠杆菌中的表达及性质

用PCR方法从副溶血弧菌8621.4基因组中扩增出1种细胞复苏促进因子家族的糖蛋白酶(Glycoprotease,Gcp)基因,核酸序列分析表明其含有完整的gcp基因开放阅读框,编码233个氨基酸组成的蛋白质。核酸序列与副溶血弧菌糖蛋白酶家族基因的序列相似性为100%。其氨基酸序列与哈维氏弧菌HY01、弧菌Ex25、溶珊瑚弧菌、拟态弧菌和杀鲑弧菌LFI1238等糖蛋白酶的序列相似性为67%～92%。将该基因克隆到表达载体pET28a,在大肠杆菌BL21(DE3)中诱导表达,用Ni琼脂糖亲和柱层析纯化的蛋白为单一条带,利用纯化的Gcp免疫新西兰大白兔制备特异性抗体,Western-Blotting分析发现正常生长及活的非可培养状态(VBNC)诱导过程中的副溶血弧菌细胞内表达的Gcp蛋白为1条带,分子量约为27kDa,而在VBNC状态的菌体中检测到2条蛋白带。研究结果为进一步探索海洋弧菌活VBNC的形成和复苏机制奠定基础。