组织工程人角膜内皮的体外重建及其形态结构

目的:组织工程人角膜内皮(tissue-engineered human corneal endothelia,TE-HCE)的体外重建及其形态结构。方法:用有限稀释法从HCE细胞系筛选出单克隆细胞(mcHCE细胞),用常规染色体标本制作和核型分类学方法进行核型分析。用羊膜的胰酶倒置消化和细胞外基质蛋白包被方法制备去上皮层修饰羊膜(mdAM)。以核型正常的对数期mcHCE细胞为种子细胞,以平铺于24孔培养板孔底的mdAM为载体支架,用200mL/L胎牛血清-DMEM/F12培养液在37℃,50mL/LCO2培养箱中进行TE-HCE的体外重建。用茜素红染色、冰冻切片HE染色、倒置显微镜和扫描电镜观察种子细胞的形态、细胞连接的形成情况、细胞单层的完整性及其与mdAM结合的紧密程度。用透射电镜方法鉴定种子细胞的超微结构以及细胞连接的形成情况。用免疫荧光技术检测种子细胞对不同细胞连接蛋白的表达模式。结果:从非转染HCE细胞系中筛选出了7个核型正常(2n=46)的单克隆细胞株。在启动重建30h后,mcHCE种子细胞在mdAM上形成了完整的细胞单层,细胞密度高达3413/mm2。HCE细胞呈多角形细胞形态,形成了完整的细胞单层,且在细胞-细胞以及细胞-mdAM间形成了多种细胞连接,种子细胞在超微结构上与在体HCE细胞类似,胞质中含有许多线粒体,并具有紧密连接蛋白-1、钙黏蛋白、间隙连接蛋白-43和整联蛋白αv/β5的阳性表达。结论:体外重建的TE-HCE在结构和功能上与在体HCE相似,有望作为HCE的替代物用于临床角膜内皮移植。

盐酸奥布卡因对人角膜内皮细胞影响作用的实验研究

目的:揭示眼科局部麻醉剂盐酸奥布卡因(oxybuprocaine hydrochloride,OBPC-HCl)对体外培养人角膜内皮(HCE)细胞的影响作用,为眼科临床安全用药提供实验依据。方法:用不同浓度OBPC-HCl处理体外培养的HCE细胞,在倒置显微镜下观察细胞的生长和形态变化,用吖啶橙/溴化乙锭(AO/EB)荧光双染色法检测质膜的通透性,用琼脂糖凝胶电泳法检测DNA的断片化,用透射电镜检测细胞的超微结构。结果:OBPC-HCl在62.5mg/L～4g/L的浓度范围内均能不同程度地引起HCE细胞出现细胞皱缩、胞内空泡化、质膜通透性增大、染色质凝缩、凋亡小体和DNA断片化等典型的细胞凋亡特征,并具有浓度和时间依赖性,临床使用浓度4g/LOBPC-HCl对HCE细胞的凋亡诱导作用最大,处理1h后HCE细胞的凋亡率已高达100%。结论:OBPC-HCl在62.5mg/L～4g/L的浓度范围内能显著诱导HCE细胞凋亡,在眼科临床应用中对HCE细胞的毒副作用极大。

转化生长因子-β2体外抑制人角膜内皮细胞增殖的作用

目的:研究转化生长因子TGF-β2对体外培养人角膜内皮细胞(HCEC)增殖的影响机制。方法:体外培养经血清饥饿法获得同步化的HCEC,用不同浓度TGF-β2对HCEC进行不同时间的处理,采用细胞计数、MTT染色以及流式细胞仪(FCM)和RealtimePCR检测TGF-β2对HCEC的增殖、细胞周期及细胞中p27kip1和p21cip1表达的影响。结果:TGF-β21～15μg/L对HCEC有显著的增殖抑制作用,具有浓度和时间依赖性,9μg/L是TGF-β2抑制HCEC细胞增殖的峰浓度。9μg/LTGF-β2处理后,处于G1/G0期HCEC数量显著增加,并具有时间依赖性。9μg/LTGF-β2处理24h后,p27kip1表达量显著增加,48h后p27kip1和p21cip1的表达量均显著增加,也具有时间依赖性。结论:TGF-β2对HCEC具有显著的浓度和时间依赖性增殖抑制作用,可能通过先后诱导p27kip1和p21cip1表达量的增加将细胞拘留在G1/G0期来实现的。

组织工程人角膜内皮在维持新西兰兔角膜透明中的效果研究

为了评价组织工程人角膜内皮(TE-HCE)维持动物角膜透明的效果,利用来自非转染人角膜内皮(HCE)细胞系的核型正常单克隆细胞株为种子细胞、以去上皮层修饰羊膜为载体支架体外重建的TE-HCE,对新西兰兔进行了穿透性角膜内皮移植试验,利用肉眼观察了移植兔眼的水肿和免疫排斥情况,利用裂隙灯显微镜检测了移植兔角膜的透明情况,并利用荧光显微镜检测了移植兔角膜内皮细胞的CM-DiI标记。对撕除后板层新西兰兔眼进行TE-HCE穿透性角膜内皮移植实验的观察和检测结果显示,移植后的兔眼角膜没有出现明显的水肿和排斥等不良反应,使移植兔角膜维持透明的时间长达100d,且角膜内皮移植区的细胞均为带有CM-DiI标记、来自TE-HCE的种子细胞。由此可见,体外重建TE-HCE移植后能使新西兰兔角膜长期保持透明,有望作为HCE的替代物用于角膜内皮失代偿和角膜内皮盲的临床移植和治疗。

人角膜内皮细胞株的建立与组织工程人角膜内皮的体外重建

为了体外重建出可用于角膜移植的组织工程人角膜内皮(TE-HCE),本文从业已建立的非转染人角膜内皮(HCE)细胞系中筛选出单克隆细胞株(mcHCE),并以其为种子细胞对TE-HCE的体外重建进行了研究。经有限稀释法从非转染HCE细胞系筛选出了mcHCE细胞株,形态结构、染色体分析以及细胞连接蛋白和膜运输蛋白的检测结果显示,mcHCE2401单克隆细胞株细胞具有正常而稳定的形态、结构和二倍染色体核型,并能表达细胞连接蛋白和膜运输蛋白,具有TE-HCE种子细胞的理想特征。以mcHCE2401细胞为种子细胞、以去上皮层修饰羊膜(mdAM)为载体支架体外重建出了TE-HCE,形态结构鉴定结果显示,多角形mcHCE2401种子细胞在mdAM上形成了连续、完整的细胞单层,在细胞之间以及细胞与mdAM之间均形成了广泛的细胞连接,单层细胞密度高达(3 602.22±45.22)个/mm2(相当于0～3岁孩童HCE的细胞密度),所重建单层角膜内皮的形态结构与在体HCE高度近似。可见,本文成功建立了形态结构、核型以及功能蛋白表达正常的单克隆细胞株,并利用mcHCE2401细胞和mdAM在体外成功重建出了形态结构与与在体HCE高度近似的最"年轻"的TE-HCE,有望作为捐献角膜内皮的等效替代物用于角膜内皮异常疾病的临床治疗。

组织工程人角膜基质体外重建的研究进展

从种子细胞和载体支架两个方面的最新研究成果,对组织工程人角膜基质的体外重建及其研究中存在的问题与解决途径进行综述。

人类角膜基质细胞研究进展

人角膜基质细胞存在于角膜基质层中,在正常状态下为静止状态,呈扁平、树枝状,在维持角膜透明性中起重要作用,细胞间通过间隙连接进行物质和信息交换。就角膜基质细胞的分布、不同表型、功能及其与角膜疾病的关系作了综述。

体外培养人角膜内皮细胞的UVB损伤及抗坏血酸的抗氧化保护作用研究

以非转染人角膜内皮（HCE）细胞系为体外实验模型系统研究了UVB氧化损伤、Asc抗氧化保护及其分子机理。体外培养的HCE细胞经UVB和/或Asc处理后,利用MTT和光镜对细胞的活力和形态进行了检测,利用8-羟基脱氧鸟苷免疫荧光染色对DNA的氧化损伤进行了检测,并利用二氢乙啶染色对胞内活性氧（ROS）的水平进行了检测。结果显示,100-800 mj/cm^2的UVB辐射能剂量和时间依赖性地损伤HCE细胞的活力;200 mj/cm^2UVB（自然太阳光中的平均辐射剂量）能引起HCE细胞发生皱缩,并显著增加细胞的DNA氧化损伤程度及胞内ROS水平;而1 mmol/L Asc不仅能显著增强HCE细胞的活力、促进细胞分裂,而且还能显著降低200 mj/cm^2UVB所引起的DNA氧化损伤及胞内ROS水平。综上所述,UVB通过诱导ROS的产生进而引起DNA氧化损伤,对HCE细胞具有显著的氧化损伤作用;而Asc能够通过降低UVB诱导的ROS水平进而保护DNA免受氧化损伤,对HCE细胞的UVB损伤具有一定的抗氧化保护作用。本文研究结果对于利用Asc等抗氧化保护剂保护HCE细胞免受UVB氧化损伤具有一定的理论指导价值。