烟草Hsc70-2的克隆及对马铃薯Y病毒侵染烟草的促进作用

【目的】马铃薯Y病毒(Potato virus Y,PVY)是危害烟草、马铃薯、番茄、辣椒等主要农作物的重要病毒,给农业生产带来巨大损失。论文旨在克隆Hsc70-2蛋白在本氏烟(Nicotiana benthamiana)中的基因序列并分析其生物学信息,研究NbHsc70-2蛋白对PVY侵染烟草的影响,为进一步解析PVY的侵染机制提供理论依据。【方法】以本氏烟为材料,克隆NbHsc70-2蛋白的基因编码序列(coding sequence,CDS),利用MEGA 6.0进行多序列比对并构建系统进化树;利用实时荧光定量PCR(qRT-PCR)分析NbHsc70-2在本氏烟各组织中的表达水平;采用在线软件BaCeILo和SignalP 4.0对NbHsc70-2进行生物信息学分析;构建NbHsc70-2-RFP融合蛋白确定该蛋白的亚细胞定位;研究PVY处理对本氏烟叶片中NbHsc70-2的影响;利用激光共聚焦观察PVY-GFP处理对NbHsc70-2-RFP定位的影响;构建NbHsc70-2 VIGS沉默体系及瞬时表达载体,采用qRT-PCR比较NbHsc70-2在沉默/过表达后对PVY表达的影响。【结果】NbHsc70-2编码649个氨基酸,系统进化树分析表明,NbHsc70-2与普通烟NaHsc70-2序列相似性最高,亲缘关系最近,属于热激蛋白家族,C端具有热激蛋白家族的高度保守基序结构;qRT-PCR分析表明,NbHsc70-2在叶中表达量最高,在根和茎中的表达量较低;BaCeILo预测及激光共聚焦显微镜观察均显示NbHsc70-2定位在细胞质中,并且PVY-GFP侵染本氏烟后NbHsc70-2-RFP部分转移至细胞核,与PVY-GFP共定位在细胞质及细胞核中;将NbHsc70-2基因沉默载体pTRV::NbHsc70-2导入本氏烟中7 d后相比于对照组,沉默组出现心叶皱缩及矮化现象;接种PVY-GFP 7 d后通过手持紫外灯观察到沉默组中无明显绿色荧光出现,而对照组中PVY-GFP系统侵染使得非接种叶片呈现荧光现象,沉默组荧光点数约为对照组28%;接种PVY后,利用qRT-PCR检测沉默NbHsc70-2后1、3、5 d的PVY CP基因积累量,结果表明沉默NbHsc70-2后PVY CP基因积累量下降,其中3 d和5 d与对照相比差异显著,基因表达水平分别为对照的14%和0.004%;将NbHsc70-2过表达载体pEarleyGate100::GWC::NbHsc70-2与PVY同时导入本氏烟后,结果表明相比于对照组,过表达组48 h和72 h其PVY CP基因积累量显著上升,基因表达水平分别为对照组的2.31、2.56倍。【结论】PVY侵染会引起NbHsc70-2表达量上升;NbHsc70-2是PVY侵染本氏烟重要的组成成分,沉默该基因显著抑制PVY的表达,过表达NbHsc70-2则显著提高PVY的表达,即NbHsc70-2的表达水平与PVY复制呈正相关,NbHsc70-2蛋白促进PVY对烟草的侵染。

产香细菌的筛选及香气成分分析

【目的】微生物在提高烟叶品质和生产天然香精香料中均具有重要的意义。本研究探究了烟叶中分离出的产香菌株的产香特性,以及菌株的应用特征。以期为该菌株的应用提供研究基础。【方法】应用烟叶浸提物培养基对醇化初期的烟叶表面细菌进行了分离,并通过发酵产香筛选得到1株具有明显香味的细菌M-5,采用分子生物学方法对产香菌株M-5进行了初步鉴定,并利用气相色谱—质谱(GC-MS)联用技术分析了发酵液的香气成分。【结果】菌株M-5被初步鉴定为蜡样芽孢杆菌(Bacillus cereus),进一步分析菌株M-5利用烟叶发酵液的香气成分,其所产生的香气物质较多,主要有2,3-丁二醇(23.89%)、苯乙酮(9.04%)、苯乙醇(8.13%)、丁酸乙酯(6.07%)、乙酸丁酯(4.46%)和棕榈酸(2.82%),这些物质在改善烟叶品质和香精香料中都有应用。【结论】M-5菌株不仅在烟叶醇化中被用于提高烟叶香气、改善烟叶吸味等,还在制备烟叶香料香精方面有着潜在的应用前景。

增香细菌HD-7的鉴定及香气成分分析

产香微生物的研究对天然香料的绿色生产具有深远的意义。本文从醇化中期的烟叶上分离得到一株细菌HD-7,根据形态学、生理生化以及16S rRNA基因序列等特征,对产香菌株HD-7进行了初步鉴定,并利用气相色谱-质谱(GC-MS)联用技术分析其发酵液的成分。结果表明,菌株HD-7初步被鉴定为短小芽孢杆菌(Bacillus pumilus);其GC-MS检测出的物质中含有较多的香气物质,主要的增香成分有丙酸乙酯,乙酸,乙酸丙酯及3-羟基-2-丁酮(乙偶姻)等,其含量分别占25.56%,12.68%,6.80%,4.86%。其中丙酸乙酯及3-羟基-2-丁酮等都是广泛使用的香料。产香细菌HD-7在生产香料上具有很大的研究价值。