剑麻PGIP基因克隆和表达研究

多聚半乳糖醛酸酶抑制蛋白(polygalacturonase inhibitor proteins, PGIPs)是一类与植物自身免疫相关的多功能蛋白,在植物防卫反应中扮演着重要角色。为了探讨剑麻PGIP基因的功能,本研究利用PCR的方法从剑麻H.11648中克隆2个剑麻PGIP基因--AhPGIP1和AhPGIP2。利用荧光定量PCR(qRT-PCR)分析AhPGIP1和AhPGIP2基因在烟草疫霉侵染、伤害、低温、盐胁迫、水杨酸(SA)和茉莉酸甲酯(MeJA)处理后的表达模式。结果表明:AhPGIP1基因cDNA全长为1008 bp,编码335个氨基酸,蛋白分子量约为36.7 kDa,等电点为8.65。AhPGIP2基因全长为981 bp,编码326个氨基酸,蛋白分子量约为35.8kDa,等电点为8.98。AhPGIP1基因在烟草疫霉侵染过程中表达水平先下降后明显上升,侵染48h达到最大值,在盐、伤、SA和MeJA处理后表达水平明显上升,分别在3、12、3、12h达到最大值,低温处理6 h表达水平不变,3、12、24 h表达水平明显下降。AhPGIP2基因在烟草疫霉侵染24、36、48 h表达水平明显下降,侵染72 h明显上升并达到最大值,在盐胁迫、低温、SA和MeJA处理后表达水平明显上升,分别在3、24、3、12h达到最大值,在伤处理12h后显著上升并达到最高水平,在3、6、24h明显下降。本研究为深入探讨剑麻PGIP基因在不同逆境胁迫反应中的功能奠定了基础。

烟草疫霉侵染后剑麻H.11648叶片细胞超微结构和防御酶活性研究

斑马纹病是剑麻的主要病害之一,本研究以剑麻斑马纹病高感品种H.11648为材料,分别在接种烟草疫霉0、24、36、48、72 h取样,用电镜观察H.11648叶片细胞超微结构变化,同时分析过氧化氢酶(CAT)、过氧化物酶(POD)、苯丙氨酸解氨酶(PAL)、多酚氧化酶(PPO)、抗坏血酸过氧化物酶(APX)和超氧化物歧化酶(SOD)等防御酶活性变化情况。结果表明:H.11648在接种24 h,可见大量休止孢,叶绿体结构被破坏,植物组织开始降解,随着时间延长,附着孢出现,吸器形成,植物组织解体更严重,接种72 h,可见大量菌丝。在整个接种过程中,CAT、PAL和PPO活性显著增强,72 h达到最高,分别为501.44、25.73、1 742.67 U/(g.min)。SOD和APX活性显著下降,72 h达到最低,分别为2 888.62 U/g和841.96μmol/(g.min)。POD活性先下降72 h又上升,但均显著低于接种前POD活性。本研究从细胞学和生理水平为探讨剑麻与烟草疫霉互作关系提供了理论基础。

剑麻均一化文库构建及PnRXLR5863靶蛋白筛选

剑麻是硬质纤维的主要来源,由烟草疫霉(Phytophthora nicotianae)引起的斑马纹病是剑麻生产的重要病害。RXLR效应蛋白是卵菌第一大类效应蛋白,能通过直接的蛋白质相互作用,靶向寄主防卫相关蛋白,干扰和抑制寄主防卫。利用转录组分析不同侵染阶段的烟草疫霉,发现PnRXLR5863表达量较高,并且其编码的蛋白含有信号肽、RXLR-EER和WY结构域,瞬时表达发现PnRXLR5863能引起烟草细胞死亡,推测PnRXLR5863在烟草疫霉侵染剑麻过程发挥重要作用,但是它作用于剑麻的靶蛋白和致病机制还未知。为了筛选PnRXLR5863的剑麻靶蛋白,应用Switching Mechanism at 5'end of RNA Transcript(SMART)和Duplex-Specific Nuclease(DSN)技术构建了剑麻均一化酵母cDNA表达文库,并筛选了与PnRXLR5863相互作用的蛋白。结果显示,构建的文库库容为5.32×10^(7)CFU/mL,文库总克隆数为1.064×10^(8)CFU,文库片段平均大小为1000 bp,重组率为100%;构建的pGBKT7-PnRXLR5863诱饵载体无自激活性;利用酵母双杂交系统,以pGBKT7-PnRXLR5863诱饵载体,从构建的文库中筛选获得23个与PnRXLR5863相互作用的蛋白。获得的候选靶蛋白主要参与分子功能和生物过程,涉及泛素化过程、蛋白合成、蛋白翻译和蛋白修饰等生理事件,暗示PnRXLR5863效应蛋白可能作用于剑麻的蛋白代谢。剑麻均一化酵母表达文库的构建和PnRXLR5863靶蛋白的筛选,为进一步深入研究PnRXLR5863的致病机理奠定基础。

娄彻氏链霉菌XL-6的抑菌活性及对茄子幼苗的防病促生效应

本文研究了娄彻氏链霉菌Streptomyces rochei XL-6无菌发酵液在自然状态下的抑菌活性及对茄子幼苗的防病促生效果。结果表明,菌株XL-6发酵液的抑菌活性物质可耐70℃高温,在pH 5~8其抑菌活性保持稳定;该抑菌活性物质不受紫外线、蛋白酶K和胰蛋白酶的影响,在4℃条件下贮藏28 d仍可保持良好的抑菌活性。采用不同浓度的发酵液处理茄子幼苗均可提高茄苗对青枯病的抗性,其中,施用40倍发酵液显著降低茄子青枯病发病率和病情指数并显著提高PAL和PPO酶活性,对盆栽茄子的防治效果达64.78%。同时,40倍发酵液显著提高茄子种子发芽率、鲜重、叶绿素含量及根系活力,较病原菌菌体处理和无菌水处理,茄苗干重增幅分别达15.81%和27.95%,对茄苗的促生效果显著。说明适宜浓度的拮抗菌XL-6发酵液兼具防治茄子青枯病和促进植株生长的效果。

利用EMS进行茄子种质资源创新

【目的】利用EMS诱变进行茄子种质资源创新,为茄子新品种选育及其相关基因功能研究提供良好材料。【方法】在25℃下利用不同浓度(0、0.5%、1.0%、1.5%和2.0%)的EMS溶液诱变处理茄子种子,筛选出适宜的EMS诱变浓度;然后以适宜浓度的EMS诱变液处理茄子种子,经过催芽后播种、定植,在植株的整个生育期进行相关性状调查。【结果】以1.0%EMS诱变处理18 h后,茄子种子的发芽率可达80%,适宜构建茄子突变体库。20 g茄子种子经1.0%EMS诱变处理18 h后催芽播种,最终获得984份M1代突变材料,且这些突变材料在长势、叶片形状、叶片颜色、分枝数、果实长度、果实颜色及雄性不育等方面表现出丰富的变异。【结论】经EMS诱变处理获得的M1代茄子表现出丰富的变异,可为其新品种选育及基因功能研究提供良好材料。

剑麻内参基因筛选与稳定表达分析

为了筛选剑麻中稳定表达的内参基因,保证基因表达结果的可靠性,本研究以热麻1号为材料,采用实时荧光定量RT-PCR方法对来自剑麻转录组数据的8个内参基因(EF1α、MADH、ACT2、GAPDH、TUB、ACT54、CYP和EF1β)在烟草疫霉侵染、水杨酸(SA)、茉莉酸甲酯(MeJA)和脱落酸(ABA)处理过程中的表达水平进行检测,并结合GeNorm、BestKeeper和NormFinder软件综合评价8个内参基因的稳定性。结果表明:8个内参基因在不同处理下的表达稳定性存在显著差异,其中在烟草疫霉侵染和茉莉酸甲酯处理过程中,EF1α表达最稳定,EF1β表达最不稳定。在水杨酸处理过程中,EF1α表达最稳定,ACT2表达最不稳定。在脱落酸处理过程中,GAPDH表达最稳定,ACT54表达最不稳定。该结果为剑麻基因的表达分析提供了可供选择的内参基因。

剑麻EST-SSR在丝兰麻和中美麻中的通用性分析

采用聚丙烯酰胺凝胶电泳技术,对剑麻‘H.11648’中的100对SSR引物在丝兰麻和万年兰中的通用性进行分析,同时构建DNA指纹图谱。结果表明100对SSR引物,在龙舌兰属、丝兰麻属、中美麻属中分别有68对、52对和52对SSR引物扩增出目标产物条带,扩增产物所占比例分别为68%、52%和52%,多态性引物分别为18对、12对和9对,多态性引物所占比例分别为29.51%、23.08%和17.31%。检测位点数分别为76、44和40个,平均每对引物多态位点数分别为2.67、2.42和2.22个。引物C67656和C61418可将龙舌兰属的6份种质区分开来,引物C65059可将丝兰麻属的5份种质区分开,引物C24110可将中美麻属的4份种质区分开。以上研究结果表明,从‘H.11648’开发的SSR引物在龙舌兰及其近缘属中是可以通用的,筛选出的SSR引物可用于龙舌兰及其近缘属种质资源的鉴定和遗传多样性分析等研究。

适宜浓度的硅可提高茄子青枯病抗性和抗氧化酶活性

以高感青枯病的茄子品种"快圆茄"为实验材料,在水培条件下,分别用含不同浓度(0、0.5、1.0、1.5、2.0、2.5 mmol/L)K_2SiO_3的营养液培养茄苗,研究不同浓度的硅对茄苗干物质积累的影响;接菌条件下,研究不同浓度的硅对青枯病的防治效果以及关键抗氧化酶活性的影响。结果表明:接菌前,与其他处理相比,1.5 mmol/L和2.0 mmol/L硅处理均显著增加茄苗的干物质重、根部和茎部硅含量;接菌后,两个处理的根系活力一直显著高于其他处理,而MDA含量及病情指数均显著低于其他处理,其防病效果分别达36.77%和37.43%。整个侵染过程中,上述2个处理的PAL和PPO活性均显著高于其他几个浓度处理,至接菌13 d后,1.5 mmol/L和2.0 mmol/L硅处理的PAL活性分别比0.0 mmol/L硅处理(对照)高55.32%和59.87%;而PPO活性则分别高52.38%和49.77%。同时,茄苗青枯病病情指数与根部硅含量、PAL和PPO活性呈极显著负相关,而与根部MDA含量表现为极显著正相关。综合评价不同硅浓度处理对茄苗促生效果和防病效应,以1.5~2.0 mmol/L的硅浓度处理较为适宜。

剑麻酵母双杂交cDNA表达文库的构建及与AhKNOX2相互作用蛋白的筛选

植物KNOX(Knotted1-likehomeobox)可通过蛋白质相互作用参与调控落果、纤维细胞发育、次生细胞壁发育、开花等事件。为筛选剑麻叶中与AhKNOX2相互作用的蛋白,采用SMART同源重组技术构建剑麻叶片酵母双杂交表达文库,利用AhKNOX2为诱饵筛选与之相互作用的蛋白。结果表明:文库总容量为3.9’106CFU,转化效率为9.15’105CFU/μgpGADT7-Rec,插入片段大小主要分布于0.5~3.0kb之间,重组率为92%,保存的文库细胞密度为1.35’108/mL,文库滴度为2.22’107 CFU/mL。构建的pGBKT7-AhKNOX2诱饵载体存在自激活性,5 mmol/L的3-氨基-1,2,4-三唑(3-Amino-1,2,4-triazole,3-AT)能抑制诱饵载体的自激活,通过筛选获得了16个与AhKNOX2相互作用的蛋白。本研究成功构建剑麻叶片酵母表达文库,并筛选获得与AhKNOX2相互作用的蛋白,该结果为进一步研究AhKNOX2在剑麻中的功能奠定前期基础,为培育高纤维产量的剑麻新品种提供基因资源和理论基础。

基于转录组的剑麻SSR标记开发与筛选

本研究基于剑麻转录组测序获得的70110条Unigene序列,采用MISA 1.0软件查找SSR位点,利用Primer 3.0设计SSR引物,通过聚丙烯酰胺凝胶电泳技术对其中的100对SSR引物有效性进行验证。总计获得了13175个SSR位点,SSR的分布频率为15.61%。70110条Unigene序列总计包括60种重复基元,其中单核苷酸重复为主导重复类型(37.96%),其次是二核苷酸重复和三核苷酸重复,比例分别为32.92%和27.90%,四核苷酸、五核苷酸、六核苷酸重复所占比例总计为1.21%。A/T、AG/CT和AGG/CCT分别为单核苷酸、二核苷酸和三核苷酸重复的优势基元。100对SSR引物中有68对引物可扩增出目标产物,其中18对引物在6份剑麻种质中表现出多态性,该结果为利用SSR分子标记技术开展剑麻种质资源鉴定、遗传多样性分析等奠定基础。