橡胶树MSAP反应体系优化及其不同开割高度单株DNA甲基化分析

以‘热研7-33-97’橡胶树无性系幼嫩叶片为材料,通过利用单因素和正交试验相结合的方法,对酶切、预扩增和选择性扩增3个影响甲基化敏感扩增多态性(MSAP)分析的关键步骤的反应体系中关键影响因素进行了优化,建立橡胶树MSAP反应最佳体系,并用于高低割线橡胶树基因组DNA甲基化差异分析。结果表明:在50μL反应体系中,750 ng基因组DNA用EcoRⅠ20 U,HpaⅡ20 U或MspⅠ10 U于37℃恒温同步酶切10 h,酶切完全。最佳预扩增体系(20μL)为:连接产物4μL,Mg Cl_2(25 mmol·L^(-1))0.15μL,d NTPs(2.5 mmol·L^(-1))0.1μL,上下游引物E-00/HM-00(10μmol·L^(-1))各0.3μL,Taq酶(5 U·μL^(-1))0.1μL,10×PCR Buffer 2μL。最佳选择性扩增反应体系(20μL)为:稀释20倍的预扩增产物2μL,Mg Cl_2(25 mmol·L^(-1))0.1μL,d NTPs(2.5 mmol·L^(-1))0.125μL,上下游引物E+3/HM+3(10μmol·L^(-1))各0.4μL,Taq酶(5 U·μL^(-1))0.1μL,10×PCR Buffer 2μL。高低割线树DNA的甲基化比例分别为37.22%和36.43%,2种开割胶树基因组CCGG位点胞嘧啶全甲基化率明显高于半甲基化率,推测橡胶树基因组甲基化主要模式可能是Cp G型。综上表明,建立的MSAP反应体系稳定可靠且重复性好,为后续橡胶树不同胁迫(割胶)程度DNA甲基化的研究奠定了基础。