利用橡胶树来源β-石竹烯新合成酶构建工程酿酒酵母的研究

为了利用生物技术高效合成β-石竹烯,该研究从橡胶树(Hevea brasiliensis)中筛选并鉴定到β-石竹烯新合成酶,并构建高产β-石竹烯酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)工程菌株。结果表明,在橡胶树中筛选鉴定出一个新的β-石竹烯合成酶基因,命名为HbBACS,其与已报道的β-石竹烯合成酶相比,编码蛋白的氨基酸序列同源性和相似性均较低。利用密码子优化的该基因构建工程酿酒酵母YCAR02,其β-石竹烯摇瓶发酵产量为206 mg/L。进一步对工程酿酒酵母YCAR02进行两阶段分批补料发酵,在添加10%肉豆蔻酸异丙酯覆盖剂的条件下,5 L发酵罐中β-石竹烯产量达到8.47 g/L。橡胶树来源的新β-石竹烯合成酶活性较高,这为利用合成生物技术规模化生产β-石竹烯提供了新的思路与方法。

橡胶树热垦525胚性悬浮细胞系的建立及其胚性能力的维持

易碎胚性愈伤组织和胚性悬浮细胞系都是基因工程和细胞工程的理想受体材料。然而橡胶树(Hevea brasil-iensis)易碎胚性愈伤组织诱导频率低、耗时长,且其胚性能力通常随继代次数的增加而下降甚至完全丧失,限制了相关研究的持续开展。因此,快速获得易碎胚性愈伤组织,建立具有高效体胚发生能力的胚性悬浮细胞系,并尽可能较长时间维持其胚性能力是当前橡胶树基因工程和细胞工程研究的重要内容。本研究以橡胶树热垦525未成熟花药为外植体进行愈伤组织的诱导和胚性悬浮细胞系的建立,分析比较固液2种长期继代方式对维持其胚性能力的影响。结果表明:花药外植体在愈伤诱导培养基中获得的黄色致密初代愈伤组织体胚发生能力低,分散性差,不适合进行悬浮培养。将初代愈伤组织转移至胚性愈伤组织诱导培养基中培养70~80 d后,可观察到有胚性结构的形成和早期体细胞胚发生,同时周围长出鲜黄色小颗粒状易碎胚性愈伤组织。通过常规方法建立的Ⅰ型胚性悬浮细胞系具备胚性细胞的典型特征,体胚发生能力显著高于胚性愈伤组织,但在体胚发生过程中容易重新愈伤化;而通过筛选特定形态的胚性愈伤组织低密度启动悬浮培养建立的Ⅱ型胚性悬浮细胞系,在显微镜下可观察到细胞处在有序的胚性结构中,其体胚发生频率可达100%。在含2 mg/L2,4-D的液体培养中持续继代2 a后细胞明显老化且增殖缓慢,体胚发生能力几近丧失;而在去除2,4-D并添加低浓度脱落酸(0.1 mg/L)和水解酪蛋白(0.5 g/L)的固体培养基上持续继代2 a后,体胚发生能力仍能维持在较高水平。所建立的Ⅱ型胚性悬浮细胞系可为橡胶树遗传转化及原生质体培养等相关研究长期提供优质充足且状态相对稳定的材料来源。

海南热研73397等5个橡胶树品种全年割胶周期生胶质量变化

天然橡胶的质量和性能与橡胶树品种、割胶生产、气象、物候等遗传和环境因素密切相关。为了探明橡胶树不同品种之间及4—12月全年割胶周期内生胶质量的差异与变化规律,本研究分析比较了PR107、RRIM600、热研917、热研73397和热研879等5个橡胶树品种胶乳所制备生胶的质量,并分析了各品种5月份胶乳所制备生胶的硫化特性和硫化胶的力学性能。结果表明:5个橡胶树品种生胶的门尼黏度值、氮(蛋白质)含量、挥发物含量、P0和PRI值等在4—12月全年割胶周期内表现出增加或下降的趋势,这些质量指标既反映出橡胶树品种间的基因型差异,又表现出受气象等环境因素变化的影响。其中,4个品种12月生胶的蛋白质含量均超过3.0%;热研917混炼胶的硫化特性与其他4个品种有明显差异;在S/2 d/3割制下,热研879硫化胶的拉断伸长率和拉伸强度最小。本研究结果一方面有助于指导橡胶树品种选育和割胶生产,另一方面也可以为高性能天然橡胶生产加工提供科技支撑。

橡胶树CRISPR/Cas9编辑植株出现预期表型的突变阈值

本课题组前期在橡胶树原生质体中分别实现了基于CRISPR/Cas9-RNP及质粒介导的瞬时转化基因编辑,并以HbPDS基因为靶标,在橡胶树愈伤组织中实现了农杆菌介导的稳定转化基因编辑,并获得了出现白化表型的愈伤组织,但由于橡胶树愈伤诱导体胚的技术还不稳定,导致未能获得基因编辑植株。为了获得橡胶树基因编辑幼苗,本研究继续以HbPDS基因为靶标,改用橡胶树体胚为侵染受体,开展农杆菌介导的遗传转化,经潮霉素抗性筛选获得增殖的T_0代抗性体胚,通过Cas9基因分子检测共挑选出116个阳性转化体胚,通过对靶点处的测序检测发现有5个胚块发生了基因编辑,编辑效率为4.3%。通过植株再生程序,获得了2株再生植株,表型观测均是嵌合体,表现为同一编辑植株上同时存在绿色及白化叶片。同时取白化叶片和绿色叶片进行高通量测序,发现二者均已发生了基因编辑,除了1个白化叶片发生了纯合双等位突变之外,其余叶片均为嵌合突变。其中,白化叶片编辑细胞的占比介于86%~100%之间,而绿色部位编辑细胞所占比例介于66%~69%之间,说明橡胶树CRISPR/Cas9编辑植株出现预期表型的突变阈值高于69%,介于70%~85%之间,为今后创制有表型的橡胶树基因编辑幼苗提供理论指导。同时,本研究证明了T_0代转化体胚及其获得的再生植株嵌合比例太高,不宜作为植株再生的材料,为今后通过对T_0代阳性体胚进行继代获得T_1代纯合体胚,并以T_1代体胚为转化受体获得纯合基因编辑植株提供思路。本研究首次公开报道获得了橡胶树基因编辑植株,尽管是嵌合植株,但也增进了对CRISPR/Cas9在橡胶树中作用的理解,为下一步在橡胶树中改进并应用基因编辑技术奠定基础。

非生物胁迫对橡胶树热激转录因子家族成员表达的影响

热激转录因子(heat shock transcription factor,Hsf)是一类重要的调节因子,能够使植物响应多种逆境胁迫,赋予植物多种抗逆性。通过qPCR技术,分析了30个橡胶树HbHsf家族成员在低温胁迫下橡胶树‘93-114’和‘热垦501’叶片中的表达模式,结果显示多个HbHsfs基因可被低温诱导上调表达,尤其是HbHsfA4a、HbHsfA4d、HbHsfA9b、HbHsfC1a和HbHsfC1b在低温胁迫下‘93-114’叶片中的表达量显著高于‘热垦501’。此外,HbHsfA4a和HbHsfA4d在干旱和高盐胁迫下显著上调表达,HbHsfA9b在干旱条件下极显著上调表达,HbHsfC1a和HbHsfC1b响应高盐胁迫上调表达。橡胶树HbHsfs基因响应多种逆境交叉胁迫,暗示着基因功能的多样性和复杂性。本研究为进一步解析Hsf家族成员的抗逆机理提供理论依据。

适合全周期间作的橡胶树品种热垦628花药再生体系研究

在橡胶树体胚发生再生体系研究中,如何快速获得胚性愈伤组织是能否成功建立再生体系的关键。本研究基于课题组前期的研究基础,以橡胶树花药为外植体,通过正交试验设计方案研究了毒莠定、KT、6-BA、IAA四种激素的不同浓度组合对橡胶树花药胚性愈伤组织诱导的影响,结果表明:橡胶树花药愈伤组织诱导的最优组合培养基为MS基础培养基,硫胺素0.4 mg/L、天冬酰胺300 mg/L、水解酪蛋白100 mg/L、脯氨酸100 mg/L、精氨酸100 mg/L、谷氨酰胺100 mg/L、L-半胱氨酸-盐酸盐50 mg/L、蔗糖70 g/L、椰子水50 mL/L、植物凝胶2.2 g/L,并添加毒莠定浓度20 mg/L、KT浓度2 mg/L、6-BA浓度1 mg/L、IAA浓度0 mg/L,愈伤组织诱导率达73.3%~100%。所有处理在诱导愈伤组织25~28 d左右,愈伤组织达到快速增殖时期,对胚性愈伤组织的诱导起主要作用的是毒莠定浓度,其浓度在20~30 mg/L之间时,对胚性愈伤组织的诱导有促进作用。低浓度的毒莠定虽然也能诱导愈伤组织产生,但是这些愈伤组织几乎为无胚胎发生能力的非胚性愈伤组织。同时用获得的11个体胚进行植株再生,其中出苗2株,7个只长根不抽芽,2个既不抽芽也不长根,植株再生率达18%。因此,在此研究的基础上,对愈伤组织诱导培养基配方进行进一步优化,使其能够更快地从花药中诱导出胚性愈伤组织,缩短胚性愈伤组织的诱导时间,降低变异几率,可为RITA生物反应器提供更好条件的愈伤组织起始原料。

橡胶树橡胶生物合成调控相关基因的表达相关性分析

该文通过q PCR获得了正常割胶条件下,9个茉莉酸信号途径关键环节基因Hb COI1、Hb JAZ1、Hb JAZ2、Hb JAZ3、Hb MYC1、Hb MYC2、Hb MYC3、Hb MYC4、Hb MYC5和6个橡胶生物合成相关基因Hb HRT2、Hb SRPP、HbREF、Hb HMGR1、Hb HRT1、Hb GAPDH在5个橡胶树魏克汉种质和5个1981’IRRDB种质胶乳中的表达数据;通过皮尔逊相关系数分析了这15个基因彼此间的表达相关性,分别获得105对基因的双变量相关系数(r12)和偏相关系数(r12.3),所有105对基因的双变量相关系数(︱r12︱)和偏相关系数(︱r12.3︱)的平均值分别为0.486±0.220和0.304±0.211,达到0.05的差异显著水平。其中,r12与r12.3方向相同的63对(60%),方向相反的42对(40%);︱r12︱<︱r12.3︱的23对(21.905%),︱r12︱>︱r12.3︱的82对(78.095%);双变量相关显著性P<0.05的76对(72.38%),P<0.01的59对(56.19%);偏相关显著性P<0.05的21对(20%),P<0.01的16对(15.24%)。结果显示,这两条途径中的基因表达彼此相关,这为基因表达谱分析中普遍采用的前提假设"功能相关基因的表达相关"提供了进一步的实验证据,可用于挖掘、筛选和预测与橡胶生物合成相关的未知基因,为研究橡胶树产量形成的分子调控机理提供理论基础。

橡胶树割面涂施制剂载体黏度及其成膜性比较研究

针对现有橡胶树割面涂施制剂,其载体成膜粘附性不是很理想,存在容易被雨水冲刷、成膜不均匀、容易干裂等缺陷。选择聚乙烯醇(17-88)、聚乙烯醇(24-88)、聚乙烯醇(22-99H)、壳聚糖、海藻酸钠、聚甲基纤维素钠6种常见的胶体制剂载体,对其黏度及成膜性进行评价。评价结果表明,聚乙烯醇(17-88)、聚乙烯醇(24-88)、聚乙烯醇(22-99H)三种材料黏度及成膜性相对较好,适宜作为橡胶树割面涂施制剂载体,其中聚乙烯醇(24-88)载体最佳,其浓度为5%~10%适宜。聚乙烯醇(24-88)载体黏度适中,易于配制,成膜均匀,附着力强,耐折性好,机械性能稳定,是一种较理想的橡胶树割面涂施制剂载体。

1-MCP在橡胶树死皮防控中的应用研究

考察死皮植株割线症状、胶乳产量及各胶乳生理参数,评估1-MCP对橡胶树死皮防控效果。结果表明,施用1-MCP死皮植株割线症状得到显著好转,其死皮长度恢复率为54.44%,死皮指数由试验前的69.33降低为试验后的41.33,防效达48.47%;死皮植株胶乳产量显著增加,试验前后,处理和对照单株胶乳产量分别为:6.40、37.6 mL和10.33、4.87 mL,处理植株单株增产31.2 mL,而对照植株减产5.46 mL。从胶乳生理参数来看,施用1-MCP后死皮植株的各胶乳生理参数得到不同程度的改善,其中胶乳硫醇含量的改善达显著水平。综上所述,施用1-MCP有利于改善死皮植株胶乳生理状况,增强其产排胶潜能,对防控橡胶树死皮、增加胶乳产量具有相对较好的效果。

橡胶树硫氧还蛋白基因HbTRXo2克隆、表达及功能分析

硫氧还蛋白(thioredoxin,TRX)作为氧化还原调节蛋白在植物抵御非生物逆境胁迫中发挥重要作用。本研究采用RT-PCR从橡胶树(Heveabrasiliensis)中克隆了硫氧还蛋白基因HbTRXo2,该基因编码区长594bp,编码197个氨基酸。预测HbTRXo2蛋白的分子量为21.90 kDa,理论等电点为7.59。蛋白保守结构域和系统进化分析结果显示,HbTRXo2含有TRX保守结构域,与其他植物o型硫氧还蛋白聚在一起,表明该蛋白属于o型硫氧还蛋白。实时荧光定量PCR分析表明,HbTRXo2基因在橡胶树根、树皮、胶乳、成熟叶、衰老叶、新梢、雌花和雄花组织中均表达,其中在胶乳中的表达量显著高于其他组织。同健康橡胶树相比,割面干涸橡胶树树皮和胶乳中HbTRXo2的表达量显著降低。在低温、聚乙二醇(PEG)诱导的干旱以及过氧化氢(H_(2)O_(2))和甲基紫精(MV)诱导的氧化胁迫处理下,HbTRXo2基因的表达显著上调,表明该基因参与了橡胶树对非生物胁迫的应答。为了研究HbTRXo2在抗逆中的功能,本研究构建其酵母表达载体,并转入酿酒酵母INVSc1菌株中,获得重组酵母INVSc1(pYES2-HbTRXo2)。比较重组酵母INVSc1(pYES2-HbTRXo2)和转空载体对照酵母INVSc1(pYES2)在H_(2)O_(2)、PEG和低温胁迫处理后的存活差异。结果显示,重组酵母INVSc1(pYES2-HbTRXo2)在PEG和H_(2)O_(2)处理后的存活率明显高于对照酵母,而在低温胁迫处理后的存活率明显低于对照酵母,表明转HbTRXo2基因提高了重组酵母对干旱和氧化胁迫的抗性,但降低了对低温胁迫的抗性。以上研究结果证明,HbTRXo2在橡胶树产排胶和抗逆过程中起着重要作用。本研究为进一步解析HbTRXo2在橡胶树中的生物学功能提供重要的参考依据。

橡胶树HbCPA基因的克隆、表达及生物信息学分析

N-氨甲酰基腐胺酰胺水解酶(N-carbamoylputreseine amidohydrolase,CPA)是高等植物通过精氨酸途径合成腐胺的终反应酶。利用RACE技术从橡胶树中克隆了一个CPA基因,命名为HbCPA。HbCPA序列全长1342 bp,开放阅读框为906 bp,编码301个氨基酸。HbCPA理论分子量约为33.5 kD,理论等电点为6.01。进化分析表明,HbCPA与木薯MeCPA、蓖麻RcCPA和麻风树JcCPA聚为一枝。qRT-PCR结果显示,HbCPA在橡胶树各组织中均有表达,表达量从高到低依次为树皮、叶片、雌花、雄花、茎尖;HbCPA在叶片不同发育时期表达存在变化,淡绿期最高,古铜期和衰老期表达量相当且最低;同健康树树皮相比,HbCPA在死皮树树皮中表达量明显上调;HbCPA表达受乙烯利、茉莉酸甲酯、低温、干旱、高盐、过氧化氢等调控,表明HbCPA可能参与橡胶树产排胶调控及非生物逆境胁迫响应。

橡胶树橡胶生物合成调控相关基因表达丰度比较

蛋白质是构成生命系统的基本元件之一,是大部分生物学功能的执行者。蛋白质丰度与其生物学功能息息相关,其丰度受基因表达过程中各环节严格精密的调控。其中,蛋白质丰度与其相应mRNA丰度存在较强的相关性,蛋白质丰度差异的40%可由mRNA丰度来解释。茉莉酸信号途径调节巴西橡胶树中的天然橡胶生物合成,但相关基因彼此间的表达丰度差异尚待阐明。该文比较了S/2D d3割胶制度下,15个橡胶生物合成调控相关基因COI1、JAZ1、JAZ2、JAZ3、MYC1、MYC2、MYC3、MYC4、MYC5、GAPDH、HMGR1、SRPP、REF、HRT1、HRT2以及2个常用内参基因18S、ACTIN1在10个橡胶树种质胶乳中的表达丰度差异;将ACTIN1的表达丰度设定为1,以此为标准计算出样品中其他基因的表达丰度。结果表明:相同个体中不同基因的转录丰度差异明显,不同个体中相同基因集的丰度大小排序存在一定差异;同一基因在不同个体中的转录丰度差异明显,这16个基因的最大丰度分别是最低丰度的9.43、6.04、10.02、12.29、18.82、9.22、38.46、112.83、121.36、15.34、19.09、13.54、10.05、19.80、24.83、11.82倍,他们的变异系数分别为73.05%、55.19%、69.09%、67.37%、66.59%、53.87%、83.25%、122.02%、166.34%、59.89%、70.59%、75.67%、74.20%、68.34%、84.23%、78.59%;总的来说,在群体水平上,16个基因的转录丰度从高到低依次为18S>SRPP>HMGR1>REF>MYC2/HRT1>COI1>MYC1/MYC4>GAPDH/JAZ1/MYC5>JAZ2>HRT2/MYC3/JAZ3,他们的群体平均丰度依次为ACTIN1的28382.26、43.64、11.39、7.16、5.47、5.10、1.07、0.75、0.74、0.45、0.42、0.33、0.12、0.06、0.06、0.04倍。值得注意的是,无论在个体水平还是群体水平上,18S的丰度毫无疑问是最大的,在mRNA中,SRPP的丰度最大,JAZ1大于JAZ2和JAZ3,MYC2大于MYC1、MYC3、MYC4、MYC5,HRT1大于HRT2。综上结果表明,结构基因和功能基因的丰度高于调控基因。在基因相对表达分析中,常对目的基因和内参基因作均一化处理,从而掩盖了不同基因间的真实丰度差异,因此,在基因表达分析中,既要关注基因的相对表达量,也要关注基因间的丰度差异,这有助于更全面地理解基因的功能。

巴西橡胶树次生乳管分化能力早期预测的相关基因初步研究

目前通过常规的试割测产进行橡胶树产量育种的方法,周期长且效率低,亟须改进。橡胶树次生乳管分化能力是决定橡胶产量的关键因子之一,因此,次生乳管分化能力的早期预测对缩短橡胶树产量育种周期具有重要意义。本研究采用分子生物学技术,割胶处理不同次生乳管分化能力等级的橡胶树种质的杂交后代,对水囊皮组织中的茉莉酸生物合成关键酶基因、茉莉酸途径关键环节基因和橡胶生物合成关键酶基因等20个基因的表达模式进行分析,并将基因表达与橡胶树种质次生乳管分化能力等级进行相关性分析。结果发现:茉莉酸生物合成关键酶基因HbAOCa和橡胶生物学合成关键酶基因HbHevb7在割胶处理后上调表达,且与橡胶树种质的次生乳管分化能力等级相关性较好。该方法可用于区分橡胶树种质间次生乳管分化能力的差异。研究结果不仅可以夯实橡胶树种质的乳管分化能力的早期预测方法,而且可为开发次生乳管分化能力的相关分子标记提供理论基础。

橡胶树野生种质资源产量相关性状的灰色关联度分析

【目的】天然橡胶是重要的工业原料和战略物资,在国民经济发展中具有十分重要的地位和作用,属资源约束性产业,其主要来源于巴西橡胶树,在已知的产胶植物中以橡胶树的产胶量最高,质量最好。巴西橡胶树以收获胶乳为主要经济产出,胶乳产量是受微效多基因控制的数量性状,影响因素较多,其表型值受遗传效应和环境效应影响,为全面了解橡胶树野生种质资源产量与主要相关农艺性状的关系,对橡胶树干胶产量及主要农艺性状进行研究,以期为橡胶树种质资源鉴定评价筛选以及新品种选育种研究提供科学依据。【方法】采用灰色关联度分析法,对种植于中国热带农业科学院试验场红星队的13份橡胶树野生种质资源产量及生长等相关农艺性状进行研究分析。【结果】与株次干胶产量相关的8个主要农艺性状的关联顺序为茎围>干胶含量>平均乳管个数>平均乳管列数>树皮厚度>茎围增长>侧脉胶等级>胶值比,对应权重分别为茎围0.1380、干胶含量0.1338、平均乳管个数0.1322、平均乳管列数0.1264、树皮厚度0.1205、茎围增长0.1182、侧脉胶等级0.1178、胶值比0.1143。综上,茎围、干胶含量、乳管数目、树皮厚度等性状与干胶产量的关联度较密切,对株次干胶产量影响较大。【结论】在橡胶树种质资源鉴定评价中,应以茎围、干胶含量、乳管数量等性状为重点,并兼顾其他性状对产量的潜在影响。

橡胶树蛋白激酶基因SnRK2.7的克隆及表达

为了探索蔗糖非发酵相关蛋白激酶2(Sucrose non-fermentating1-related protein kinase 2,SnRK2)在巴西橡胶树响应低温胁迫应答中的作用,采用RT-PCR技术,从橡胶树抗寒无性系93-114的叶片中克隆了SnRK2亚家族的一个成员,命名为HbSnRK2.7。该基因包含一个1095 bp的开放阅读框,编码364个氨基酸。HbSnRK2.7的分子量为41.39 kD,等电点为4.70,具有保守丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶结构域,预测其能催化磷酸基从ATP转移到蛋白质底物上的丝氨酸/苏氨酸残基上,也是磷酸化位点的集中区域,还具有非生物胁迫所需的结构域和ABA(脱落酸)依赖的HbSnRK2.7激活所需结构域。q-PCR结果显示,HbSnRK2.7基因响应ABA诱导,呈下调表达模式。在ABA处理8 h时,表达量下调到最低点。在低温胁迫下,HbSnRK2.7的表达量极显著降低。低温胁迫4 h和8 h时,HbSnRK2.7持续下调表达,低温胁迫24 h时,HbSnRK2.7表达量下调到最低,大约为非胁迫表达量的1/2。而且,HbSnRK2.7在不抗寒种质中的表达量显著高于抗寒种质。这些结果表明,HbSnRK2.7可能作为负调控因子介导橡胶树依赖ABA的低温胁迫抗性形成。

橡胶树‘热研7-33-97’死皮相关研究的qRT-PCR内参基因筛选

在橡胶树死皮以及死皮康复相关研究中,为获得可靠的基因表达结果,筛选合适的内参基因显得尤为重要。本研究以‘热研7-33-97’健康树、三级死皮树和死皮康复树为试验材料,收集其中的胶乳,采用qRT-PCR技术,结合GeNorm、NormFinder和BestKeeper三种内参筛选软件,综合分析了20个候选内参基因在不同胶乳样品中的表达情况。结果表明:eif2、ACT7a、UBC2b在健康树中较稳定;UBC3、eifAb、eifAa、ADF4、UBC4、UBC2b、eif2、RH2b、ACT7b在三级死皮树中较稳定;UBC2b、eif2和ROC3在三级死皮恢复树中较稳定。选择胶乳代谢相关基因HbDXS1、HbHMGS2和HbNIN3对候选的内参基因进行验证,筛选出本研究中适合的一组稳定可靠的内参基因是eif2和UBC2b,其中ejf2是最佳内参基因,18S不适合作为本研究的内参基因。

橡胶树茉莉酸信号途径相关基因表达与橡胶产量的相关性

割胶促进橡胶树合成天然橡胶与激活乳管细胞的茉莉酸信号途径密切相关,但茉莉酸信号途径关键环节的基因表达水平与干胶产量的相关性尚不清楚。为了找到与产量相关的分子标记,该研究采用qPCR技术,分析了割胶条件下茉莉酸信号途径关键环节的9个相关基因在5个橡胶树魏克汉种质和5个1981’IRRDB种质乳管细胞中的表达。结果表明:大多魏克汉种质的株次干胶产量显著高于1981’IRRDB种质。在9个基因中,除了HbMYC4和HbMYC5,其余7个基因在大多橡胶树魏克汉种质中的表达量均显著高于1981’IRRDB种质,尤其是HbMYC3基因表达差异性好,与干胶产量相关性高,有望作为橡胶树产量育种的一个分子标记。这对育种周期长的橡胶树产量育种具有实际应用价值。

橡胶树魏克汉种质萌条机械伤害诱导的次生乳管分化特征

【目的】分析橡胶树魏克汉种质萌条经机械伤害处理后次生乳管的分化特征,为成龄大树割胶后次生乳管的分化能力提供早期预测,为鉴定和评价魏克汉种质提供依据。【方法】选取304份魏克汉种质,用刀片刮伤其幼嫩萌条茎的表面,深至皮层。萌条受伤害5天和10天后采集茎皮,经碘-溴染色处理制备石蜡切片。光学显微镜下观察不同种质次生乳管的分化情况并进行统计,分析次生乳管出现的早晚和多少。【结果】不同魏克汉种质萌条经机械伤害处理后被诱导分化出次生乳管的能力存在明显差异。刮伤后5天,在304份种质中,有95份种质分化出明显的成列的次生乳管;有172份种质分化出未成列的分散的次生乳管;余下37份种质未检测到次生乳管。刮伤后10天,有265份种质分化出明显的成列的次生乳管,其中22份种质分化的次生乳管有2列及以上;有37份种质分化出未成列的分散的次生乳管;仅2份种质未检测到次生乳管。机械伤害处理后10天萌条分化出次生乳管的比例明显多于伤害处理后5天。不同种质受伤害诱导分化次生乳管的敏感性不同,响应强弱各异。在不同育种系列中,次生乳管诱导效果好的种质主要有大丰、保亭、热研、大岭系列,以海南选育的种质为主。根据萌条分化出次生乳管的早晚以及分化乳管的强弱程度可将304份魏克汉种质分为敏感型、敏感叠加型、迟缓型和迟缓叠加型4种类型,生产中的高产品种大多属于叠加型分化种质。【结论】不同魏克汉种质萌条经机械伤害处理后诱导分化次生乳管的反应不同,具有明显的种质特异性。机械伤害处理5天可用来筛选次生乳管分化敏感的种质,而10天更适合用来筛选分化滞后叠加的种质。在4种不同分化类型中,叠加型种质可成为筛选优良高产品种的主要来源。萌条的伤害诱导性乳管分化能力可作为高产育种早期选择的一个有效指标。

海藻酸钠/壳聚糖基橡胶树死皮康复营养剂微胶囊的制备工艺优化

橡胶树死皮已成为制约天然橡胶生产发展的重要因子之一,研发轻简、高效的死皮防治技术是目前生产中亟需解决的问题。本文以海藻酸钠/壳聚糖为壁材,橡胶树死皮康复营养剂主要有效成分为芯材,通过复凝聚反应将橡胶树死皮康复营养剂制备成微胶囊。以微胶囊的包封率、载药量为制备工艺优化指标,通过L16(45)正交实验得出微胶囊的最佳制备工艺条件。研究结果表明,当壳聚糖浓度为2.0 mg/mL、营养剂用量为1 g,体系反应温度为40℃,pH为5,10%戊二醛用量为30 mL时,该工艺条件下制备的微胶囊相对圆整、粒度分布相对均匀(10~40μm),其包封率达69.31%、载药量达14.35%。所得的最佳工艺制备条件为后期实现木质部埋植橡胶树死皮康复营养剂缓释微胶囊打下良好基础;为最终实现新型高效的橡胶树死皮康复技术应用提供依据。

橡胶树乳管细胞GPPS基因的克隆与表达分析

【目的】克隆橡胶树乳管细胞短链异戊烯基合酶(GPPS)基因,分析其表达特性和编码蛋白的相互作用,为解析该类基因在天然橡胶和萜类合成中的作用提供理论参考。【方法】采用逆转录PCR(RT-PCR)和cDNA末端快速克隆(RACE)从橡胶树乳管细胞胶乳中克隆GPPS基因(HbGPPS1和HbGPPS2),利用生物信息学分析其编码蛋白的特性;采用实时荧光定量PCR(q RT-PCR)检测HbGPPS1和HbGPPS2在树皮和胶乳中的组织表达特异性、在不同橡胶树品系中的表达模式及其对割胶和外源茉莉酸甲酯(MeJA)处理的响应模式,并在原核细胞中进行表达分析;通过酵母双杂交技术检测HbGPPS1和HbGPPS2蛋白的相互作用关系。【结果】从橡胶树乳管细胞乳胶中克隆获得HbGPPS1和HbGPPS2基因,其中HbGPPS1基因编码框长度为1248 bp,编码415个氨基酸,蛋白分子量为45.9 kD,理论等电点为6.77;HbGPPS2基因编码框长度为1239 bp,编码412个氨基酸,蛋白分子量为45.6 kD,理论等电点为6.77。二者的核苷酸序列相似性为89%,且编码蛋白均含有2个典型的异戊烯基转移酶活性结构域DDXXD(D),定位于叶绿体和线粒体。HbGPPS1蛋白自身及其与HbGPPS2蛋白均能形成较弱相互作用的二聚体。qRT-PCR检测结果显示,HbGPPS1和HbGPPS2基因在胶乳中的表达量高于树皮,但均以HbGPPS2基因表达量较高,表明二者表达存在组织特异性。经MeJA处理后橡胶树胶乳中HbGPPS1和HbGPPS2基因表达量较对照高,即外源MeJA可促进内源茉莉酸的合成,激活乳管细胞内的茉莉酸信号从而上调HbGPPS1和HbGPPS2基因表达。在5个橡胶树栽培品系中,HbGPPS2基因的表达量均明显高于HbGPPS1基因,且与PR107、热研7-20-59、RRIM600和热研7-33-97干胶含量趋势一致,但二者仅在热研8-79和热研7-33-97的表达模式存在差异。HbGPPS2基因能在大肠杆菌中成功表达。【结论】HbGPPS2基因可能是乳管细胞中参与天然橡胶和萜类合成的主效基因,而HbGPPS1基因可能是功能冗余基因。HbGPPS2和HbGPPS1基因在不同橡胶树品系中的表达模式与各品系干胶含量呈正相关,可用作为干胶含量评估的筛选标记。