芒果CHI基因的克隆及其表达分析研究

采用RT-PCR和RACE方法从芒果的果实中克隆得到了一个参与花色素苷生物合成的查尔酮异构酶基因(CHI)的全长的c DNA序列,进而对得到的序列采用了TMHMM、DNAman等软件进行生物信息学分析,发现芒果CHI基因包含编码区、3′和5′非翻译区的长度为960 bp的c DNA序列,开放阅读框为753 bp,编码250个氨基酸;等电点为6.46,分子重量为27.03 Kd;对跨膜结构域进行了预测发现,该基因无跨膜结构域;蛋白二级结构元件以无规则卷曲和β-折叠为主;聚类分析发现:该基因与美洲葡萄、葡萄、龙眼和橄榄等植物的亲缘关系较近,而与拟南芥、萝卜、文心兰等亲缘关系较远;分别对红色和绿色的叶片分析发现:该基因主要在红色叶片中表达量比较高。

芒果PAL基因的克隆与序列分析

苯丙氨酸解氨酶(phenylalanine ammonialyase,PAL)是酚类物质合成的第一个酶,是催化苯丙烷类反应的第一酶。根据已经报道的PAL基因的序列设计兼并引物,采用3′RACE和5′RACE方法,克隆得到了芒果果实PAL基因的全长cDNA序列。该基因开放阅读框为2160 bp,编码719个氨基酸,分子重量为79.18 kD。对基因组扩增得到了2200 bp长度的片段分析发现,该基因未含有内含子序列。通过系统发育分析发现,该基因编码的蛋白与问荆、杉木、银杏等植物具有较近的亲缘关系。对不同芒果品种的PAL基因的表达进行分析发现,红色的贵妃品种中表达量较高,而绿色的桂七品种中表达量较低。

芒果4CL基因的克隆及其表达分析

4-香豆酸:辅酶A连接酶(4CL)是植物类黄酮类化合物和木质素等生物合成途径的一种关键酶,为了研究其在芒果果实中的作用机理,采用RACE方法,从芒果果实克隆得到了一个类黄酮合成相关的4CL基因。该基因全长c DNA序列为1 740 bp,开放阅读框为1 653 bp,编码550个氨基酸,分子量为60.47 k Da,等电点为9.51。对基因组扩增得到了2 318 bp长度的片段分析发现,该基因含有5个内含子,分别在1 013~1 139 bp,1 330~1 415 bp,1 564~1 653 bp,1 722~1 802 bp,1 905~2 000 bp。通过在线软件对其二级结构和三级结构进行了预测,系统发育分析发现该基因编码的蛋白与水曲柳、菘蓝等植物具有较近的亲缘关系。对3种不同着色的芒果品种中的4CL基因的RTPCR进行分析发现:红色的贵妃品种中表达量较高,而绿色的桂七品种中表达量较低。研究表明4CL基因表达芒果果实着色具有密切的相关性。

芒果ANS基因的克隆及其序列分析

为了研究芒果果实中ANS基因的功能。利用同源克隆方法从芒果果实中克隆得到了一个ANS基因,该基因的c DNA长度为1 252 bp,开放阅读框的长度为1 056 bp,编码351个氨基酸。通过系统发育分析,发现该基因编码的蛋白与荔枝、葡萄、可可豆、桑树等聚在一类。通过序列对比分析表明,已经成功得到芒果ANS基因,并对其生物信息进行了分析,为下一步芒果ANS基因的功能研究打下了基础。

改良CTAB法提取番石榴总DNA的初步研究

以番石榴为试材,采用CTAB、SDS和改良的CTAB法分别从新鲜的番石榴叶片中提取DNA,并对其进行琼脂糖凝胶电泳检测和SCoT-PCR分析。结果表明:3种方法均可以从番石榴的叶片中提取DNA,但改良的CTAB方法通过加入漂洗液2次洗涤,能够较好的去除样品中的多酚、多糖和蛋白质等物质,可以较好的从新鲜的叶片中提取较高质量的DNA,并可以用于SCoT-PCR标记分析。

芒果C4H基因的克隆及其表达分析

肉桂酸-4-羟基化酶(C4H)是植物苯丙烷合成途径的关键酶之一,其蛋白质活性和转录丰度直接影响植物中黄酮类化合物和芳香族化合物的生物合成量。根据已经报道的C4H基因的序列设计兼并引物,采用3'RACE、5'RACE方法,克隆得到芒果果实C4H基因的全长cDNA序列为1 680 bp。该基因开放阅读框为1 518 bp,编码505个氨基酸,分子量为58.08 ku。蛋白等电点为9.52,分析发现该基因主要定位在线粒体中。通过软件预测得到3种三级蛋白结构图;通过系统发育分析发现,该基因编码的蛋白与橄榄、可可等植物具有较近的亲缘关系。对不同着色的芒果品种的C4H基因表达进行分析发现,红色的贵妃品种中表达量最高,而绿色的桂七品种中表达量最低。

荔枝ANS基因的克隆及其序列分析

以3个不同发育时期的‘糯米糍’荔枝果皮和幼嫩叶片为试材,对其ANS基因进行了克隆及分析。结果表明:花青素合成酶(Anthocyanidin synthase,ANS)是花色素苷生化合成途径中的一个关键酶。利用同源克隆方法从荔枝果皮中克隆得到了1个ANS基因,该基因开放阅读框的长度为1 074bp,编码357个氨基酸。以基因组为模板,扩增得到了1 279bp的核苷酸序列与cDNA序列比对发现,基因组序列中还有1个内含子,位置在504～708bp之间。通过系统发育分析发现,该基因编码的蛋白与葡萄、可可豆、柑橘等聚为一类。

芒果ANR基因的克隆及其表达分析

花青素还原酶(anthocyanidin reductase,简称ANR)基因是植物产生原花青素的关键基因,对于研究原花青素的代谢有重要的作用。根据已经报道的ANR基因的序列设计兼并引物,采用3'c DNA末端快速扩增(3'RACE)、5'c DNA末端快速扩增(5'RACE)方法,从芒果果实内克隆到1个ANR基因,其全长c DNA序列为1 201 bp。该基因开放阅读框为1 008 bp,编码335个氨基酸,等电点为5.41,分子量为36.33 ku。对基因组扩增得到了1 810 bp长度的片段,分析发现,该基因含有5个内含子,内含子位置分别为130~646 bp、733~814 bp、1 017~1 080 bp、1 259~1 349 bp、1 563~1 651 bp。通过系统发育树分析发现,该基因编码的蛋白与可可、葡萄等果树具有较近的亲缘关系。对不同芒果品种中ANR基因的表达进行分析发现,该基因在绿色的桂七品种中表达量较高,而在红色的贵妃品种中表达量较低。

芒果CCR基因的克隆及其序列分析

为了研究芒果CCR基因在芒果对芒果树抗性的功能。采用传统的RT-PCR和RACE方法从芒果的枝梢中克隆得到了1个参与木质素生物合成的肉桂酰辅酶-A还原酶基因(CCR)的全长c DNA序列,进而对得到的序列采用TMHMM、DNAMAN等软件进行生物信息学分析,发现芒果CCR基因包含编码区、3'和5'非翻译区的长度为1 292 bp的c DNA序列,编码305个氨基酸;对跨膜结构域进行了预测,发现该基因无跨膜结构域;蛋白二级结构元件以无规则卷曲和β-螺旋为主;聚类分析发现,该基因与美洲山杨木、油茶等植物的亲缘关系较近,而与百合、橡胶树等亲缘关系较远。从芒果中克隆得到了一个CCR基因,并对其生物信息学进行了分析,为后续转基因工作打下了基础。

芒果(Mangifera indica)F3’H基因的克隆及其表达分析

花色素苷的合成是红色芒果果实着色的主要代谢途径,而类黄酮3’羟化酶(F3’H)基因是花色素苷合成的一个关键酶,其参与决定了花色、果实颜色、种皮颜色、茎叶表面等花色素苷的生物合成。本研究根据已经报道的F3’H基因的序列设计兼并引物,采用3’RACE和5’RACE方法,克隆得到了芒果果实F3’H基因的全长c DNA序列为1782 bp。该基因开放阅读框为1548 bp,编码515个氨基酸,分子重量为57.44 k D。通过系统发育分析发现该基因编码的蛋白与西洋梨、草莓、大豆等具有较近的亲缘关系。对不同芒果品种的F3’H基因的表达进行分析发现:红色的贵妃品种中表达量较高,而黄色的金煌品种中表达量较低。

荔枝DFR基因的克隆及其序列分析

采用同源克隆的方法从荔枝果皮中克隆得到一个二氢黄酮醇4-还原酶(DFR)基因,该基因开放阅读框全长1062 bp,编码353个氨基酸.基因组扩增得到长度为2321 bp的片段,分析发现:该基因含有5个内含子,分别在119-255、426-1158、1353-1470、1632-1819、2013-2095 bp之间.通过系统发育分析发现,该基因编码的蛋白与山葡萄、海棠和山竹子等果树具有较近的亲缘关系.

芒果LAR基因的克隆及其表达分析

无色花青素还原酶(leucoanthocyantin reductase,简称LAR)基因是植物原花色素的一个关键基因。本研究根据已经报道的LAR基因的序列设计兼并引物,采用3'RACE和5'RACE方法,从芒果(Mangifera indica)果实中克隆得到1个LAR基因,其全长c DNA序列为1 221 bp。该基因开放阅读框为1 059 bp,编码352个氨基酸,等电点为5.78,分子质量为38.38 ku。利用生物信息学在线分析软件对该蛋白组成成分、疏水性/亲水性、二级结构、功能结构域以及三级结构进行预测和分析。通过系统发育分析发现,该基因编码的蛋白与棉花、葡萄、蓝莓、柿等具有较近的亲缘关系;对不同芒果品种的LAR基因的表达进行分析发现,绿色的桂七品种中表达量较高,而黄色的金煌品种中表达量较低。

黄皮CHS基因的克隆及其表达

为研究黄皮果实中查尔酮合成酶(CHS)的功能,以黄皮果实的cDNA和DNA为模板,采用同源克隆的方法克隆得CHS基因后进行序列比对和聚类分析。结果表明:该基因的开放阅读框为1 032bp,编码343个氨基酸。基因组扩增得到了1 100bp的片段,不含内含子。该基因主要在果实中表达,而叶片中表达较其他组织低,初步推断该基因可能与果实和花朵中的黄酮类物质合成有密切的关系。该基因编码的蛋白与柑桔的CHS蛋白序列亲缘关系较近,可与柑桔、葡萄、芍药、牡丹、荔枝、龙眼等聚为一类。

芒果CHS基因的克隆及其表达分析

为了研究芒果CHS基因的功能及其在果实着色中的分子机理,以芒果果实的c DNA和DNA为模板,采用同源克隆的方法克隆得到了一个CHS基因,该基因的开放阅读框1 194 bp,编码397个氨基酸,等电点为6.03,分子重量为43.29 k Da。基因组扩增得到了1 315 bp的片段,通过序列比对发现该基因含有1个内含子,对其在幼嫩叶片和成熟叶片中的表达进行分析,发现该基因在不同时期的叶片中都有表达,在红色幼嫩的叶片中表达量较高,成熟叶片中表达较低,初步推断该基因可能的叶片中黄酮类物质合成有密切的关系。通过聚类分析发现该基因编码的蛋白与兜兰、白芨等的CHS蛋白序列亲缘关系较近,可以与白芨、问荆草、甘蓝等聚为一类。

黄皮叶绿体基因组测序与分析

[目的]分析黄皮[Clausena lansium(Lour.)Skeels)]叶绿体基因组,为黄皮属不同种或品种的进化、杂交、演变,以及黄皮不同品种的鉴定等提供技术支持。[方法]使用试剂盒提取了黄皮的叶绿体DNA,通过测序、组装、注释获得了黄皮叶绿体基因组。[结果]黄皮叶绿体基因组全长159283bp,其中反相重复序列区(IRs)长53998bp,大单拷贝序列区(LSC)和小单拷贝序列区(SSC)长度分别为87301、17983bp,共注释126个基因,包括编码蛋白基因89个,tRNA基因29个和rRNA基因8个。黄皮叶绿体基因组全序列GC含量38.7%。对5种芸香科果树的全长序列、SSC、LSC、IRA、IRB进行比较分析发现,假黄皮的叶绿体全长序列、LSC、IRA、IRB区域的长度较其他4种果树长,柠檬的SSC区域长度最长,黄皮的全长序列和SSC区域长度最短。黄皮叶绿体的基因数目和编码蛋白数目较其他4种果树多。对20种园艺植物的叶绿体基因组进行分析发现,同一科下面的不同属植物或同一属下面的不同种更容易聚为一类。[结论]该研究丰富了热带果树的叶绿体基因组数据库,为种质资源的合理开发利用提供了依据。

芒果F3'5'H基因的克隆及其表达分析

黄酮-3',5'-羟基化酶(flavonoid-3',5'-hydroxylase, F3'5'H)是合成飞燕草色素苷的关键酶基因,缺乏F3'5'H的植物不能形成蓝色花,故又被称为“蓝色基因”。本研究根据已经报道的F3'5'H基因的序列设计兼并引物,采用3'RACE和5'RACE方法,克隆得到了一个全长cDNA序列为1598 bp的芒果果实F3'5'H基因。该基因开放阅读框为1539 bp,编码512个氨基酸,分子重量为57.20 KD。对基因组扩增得到了1633 bp长度的片段,分析发现该基因含有一个内含子。通过系统发育分析发现该基因编码的蛋白与石斛、马鞭草等植物具有较近的亲缘关系。对不同芒果品种的F3'5'H基因的表达进行分析发现:红色的贵妃品种中表达量较高,而绿色的桂七品种中表达量较低。

杧果MiPAO基因的克隆表达分析及其基因沉默载体的构建

为了探究杧果PAO基因在杧果果皮叶绿素降解中的作用,利用转录组测序得到PAO部分片段信息设计兼并引物,采取3'和5'cDNA末端快速克隆(RACE)的技术方法,选取了红色贵妃、黄色金煌、绿色桂七等3个不同着色杧果品种为试验材料,分别克隆得到了杧果果皮PAO基因的全长c DNA序列,生物信息学分析后将其命名为MiPAO。结果表明,3个着色品种c DNA序列只有几个碱基的差异,以红色贵妃品种为例,经过分析可得全长c DNA序列的大小为1 979 bp,开放阅读框大小为1 641 bp,总共编码546个氨基酸,其分子质量为61. 82 ku,等电点为6. 54。通过生物软件预测得到了MiPAO蛋白的二级结构和3种三级结构图,同时发现MiPAO蛋白为亲水性蛋白。对NCBI上登录的部分植物的PAO蛋白构建系统发育树发现MiPAO蛋白与橙子的亲缘关系近。成功构建出p TRV2-MiPAO基因沉默载体,希望能为后续研究杧果果皮着色的分子机理和桂七杧果的滞绿原因提供一定的试验支持。

芒果BCH基因的克隆与表达

β-胡萝卜素羟化酶(BCH)基因是催化玉米黄素合成的关键基因,玉米黄素在植物光保护过程中发挥着重要的作用。采用RACE方法从黄色的金煌芒果的果皮中克隆得到了1个BCH基因,该基因全长cDNA序列为1 160 bp,开放阅读框为888 bp,编码295个氨基酸,分子质量为32.97 ku,分子等电点为9.51。利用生物信息学在线分析软件对其组成成分、疏水性/亲水性、二级结构、功能结构域以及三级结构进行预测和分析。通过系统发育分析发现,该基因编码的蛋白与温州蜜柑、柚子、大豆、草莓等具有较近的亲缘关系。对不同芒果品种的BCH基因的表达进行分析发现,红色的贵妃品种中表达量较高,而黄色的金煌品种中表达量较低。

杧果MiCAO基因的克隆及植物超表达载体构建

叶绿素是植物重要的光合色素之一,其含量影响着植物最终合成的生物量或产量。CAO(Chlorophyllide a oxygenas)是叶绿素生物合成的关键限速酶之一,主要参与叶绿素b的形成。为探究杧果CAO基因的生物学功能,本研究利用RACE技术,从杧果‘金煌’品种中克隆得到MiCAO基因并对其蛋白序列进行相应的生物信息学分析、构建其植物超表达载体进行亚细胞定位和基因功能验证。本试验克隆了杧果MiCAO基因,该基因全长cDNA序列为2151 bp,开放阅读框为1608 bp,编码535个氨基酸。进化树分析表明,MiCAO蛋白与双子叶植物的开心果Pv CAO蛋白的亲缘关系最近。利用植物瞬时表达技术转化烟草,对MiCAO蛋白进行亚细胞定位显示MiCAO蛋白定位于细胞质和细胞核中;对MiCAO进行基因功能验证,结果表明转基因株系表型与野生型无明显差异,推测MiCAO基因可能不是调控叶绿素生物合成途径中的主效基因,为研究杧果叶绿素生物合成提供了一定的理论参考依据。

荆半夏叶柄一步成苗组培快繁体系的优化

以竹叶型荆半夏叶柄为外植体,研究6-BA、2,4-D对半夏一步成苗的影响,以及多效唑(PP333)、茉莉酸甲酯(MJ)、蔗糖对块茎大小的影响。结果表明,提高6-BA浓度有利于叶柄诱导率和平均每个叶柄形成块茎数提高,添加低浓度2,4-D有助于提高平均每个叶柄形成块茎数;单因素试验表明,添加多效唑和茉莉酸甲酯、增加蔗糖浓度均能增加块茎直径;正交试验表明,4个因素对半夏块茎直径的影响顺序为6-BA浓度、蔗糖浓度、茉莉酸甲酯浓度、多效唑浓度。综合考虑,荆半夏一步成苗较适宜的培养基为MS+2.0 mg/L 6-BA+0.1 mg/L 2,4-D+0.5 mg/L PP333+2.0μmol/L MJ+60 g/L蔗糖。