模式植物狗尾草响应不同干旱及盐胁迫表达的内参基因actin及其应用

为了研究应用于狗尾草响应不同干旱及盐胁迫基因表达的内参基因,本研究从网站https://phytozome.jgi.doe.gov/pz/portal.html上获得狗尾草A10品系8个actin基因的cDNA序列,设计荧光定量PCR引物,以不同程度的干旱及不同浓度盐胁迫处理的狗尾草幼苗cDNA做模板,进行荧光定量PCR试验,通过实时荧光定量PCR扩增片段电泳分析,扩增曲线及溶解曲线综合分析,结果表明登录号Sevir.9G114100对应的actin基因是8个actin基因中最合适的内标基因。并对所选内标的实用性进行了验证,验证的结果与转录组数据的结果保持一致,证明所选内标基因可用于后续狗尾草响应不同干旱及盐胁迫狗尾草转录组基因表达的验证工作,为深入研究狗尾草功能基因奠定分子基础。

广东雷州杂草稻sh4和qSH1基因的功能SNP位点序列分析

sh4和qSH1基因是水稻的主效落粒基因,本研究旨在测定雷州杂草稻的sh4和qSH1的基因型,为雷州杂草稻的落粒机制研究提供分子基础。本研究从雷州10个杂草稻群体采集了100个单株及10份栽培稻种子,观测其颖壳颜色、果皮颜色和芒及落粒率,并对sh4和qSH1的功能SNP位点进行PCR扩增及序列分析。结果表明,57份杂草稻的sh4功能SNP位点为野生落粒型(G),15份为杂合型G/T,28份为突变难落粒型(T)。其中,G型和G/T型的72份杂草稻的落粒率都极高(95%~100%),而28份T型杂草稻中,19份为中度落粒(30%~75%),5份杂草稻的落粒率很高(>95%),4份杂草稻的落粒率小于30%。100份杂草稻和10份栽培稻的qSH1功能SNP位点均为G。结合落粒表型及基因型,推测sh4是调控雷州杂草稻落粒性的一个主要基因。

狗尾草U6启动子的克隆及功能鉴定

狗尾草是重要的模式植物,是研究C4光合作用的优秀模型,具有热带植物的典型特征。U6启动子主要用于构建RNAi和CRISPR表达载体,有启动干扰发夹结构的表达和基因编辑引导序列复合结构的表达的作用,该启动子具有特殊的启动位点G,能够保证转录后RNA结构的完整性。随着CRISPR技术的发展,利用狗尾草进行基因编辑的研究日益增多和深入,目前还没有针对狗尾草U6启动子的克隆及功能鉴定。U6启动子具有种属特异性,在转基因技术中,使用转化物种本身或亲缘物种的U6启动子能取得更高的的启动效率,本研究克隆了狗尾草2个U6启动子基因,并构建不同序列长度的U6启动子序列驱动GUS基因的表达,GUS融合表达载体转化狗尾草胚性愈伤,瞬时表达验证表明,克隆出的2个狗尾草U6启动子在狗尾草上具有很强的启动效率;并且将该载体转化狗尾草后,获得了能够稳定表达GUS基因的转基因植株;将该U6启动子用于构建狗尾草PDS基因CRISPR编辑载体,获得能够稳定表达的白化苗,说明克隆的狗尾草U6启动子能够很好的启动基因编辑载体的转录。

广东雷州杂草稻黑壳基因Bh4和红皮基因Rc的基因型鉴定

为测定雷州杂草稻的黑色颖壳基因Bh4和红色果皮基因Rc的基因型,本研究对雷州10个杂草稻群体的100个单株的种子的颖壳和果皮颜色进行表型观察,同时通过PCR扩增及序列分析对Bh4和Rc的基因型进行鉴定。结果表明,雷州杂草稻中黑色颖壳和黄色颖壳的种子几乎各占一半,果皮颜色则以红色为主,有少量白色和浅红色果皮的种子。雷州杂草稻的Bh4和Rc的基因型与表型鉴定结果一致。57份黑色颖壳杂草稻的Bh4基因型为39个野生型和18个杂合型,25份黄色颖壳和18份黄色带黑斑颖壳杂草稻的Bh4基因型均为缺失22 bp的突变型;90份红色果皮杂草稻的Rc基因型为73个野生型和17个杂合型,4份白色和6份浅红色果皮杂草稻的Rc基因型均为缺失14 bp的突变型。本研究为分析雷州杂草稻的Bh4和Rc基因的来源提供了分子基础。

52个甘蔗品种在广西受病毒侵染情况

为明确国家糖料体系甘蔗集成示范及区试品种在广西被病毒侵染情况,2017年从广西北海、南宁、崇左、百色、来宾、柳城、桂林等地集成示范及区试的52个甘蔗品种上采集带有甘蔗花叶病、甘蔗黄叶病和甘蔗杆状病毒病显著病症或不显病症叶片样品,采用特异引物通过RT-PCR和PCR方法进行5种病毒检测(甘蔗黄叶病毒、甘蔗线条花叶病毒、高粱花叶病毒、甘蔗花叶病毒和甘蔗杆状病毒)。结果表明,SCYLV的平均检出率为25.00%;SCSMV的平均检出率为7.97%;SrMV的平均检出率为7.69%;SCMV的平均检出率最低,为7.42%;SCBV的平均检出率最高,为68.41%,远远高于其他病毒。7个地方的甘蔗受病毒混合侵染现象普遍存在,北海的病毒混合侵染率甚至高于单一病毒侵染率。52个甘蔗品种在广西受5种病毒的总侵染率为79.67%,对甘蔗的生产安全存在着严重的潜在威胁,建议推广种植甘蔗脱毒种苗来缓解甘蔗病毒病害的危害。

高粱高效Ubiquitin启动子的克隆及活性鉴定

在转基因植物的研究中,启动子是影响转基因表达效率的重要因素之一。植物泛素(ubiquitin)基因启动子以启动效率高、甲基化程度相对较低、遗传性状稳定等特点成为单子叶植物中应用较为广泛的启动子。其中,玉米的Ubi-1是最常使用的Ubiquitin启动子之一。本研究旨在克隆高粱高效Ubiquitin启动子,为高粱及其他单子叶植物的遗传转化研究提供新的组成型启动子选择。本研究从NCBI数据库中查找到多个polyubiquitin基因,下载其起始密码子上游3000 bp的序列。根据Ubiquitin启动子的特点,选择含有5′UTR内含子且大小合适的序列,并通过在线启动子预测网站进行启动子分析,最后选择2个基因(LOC8076096、LOC8063786)进行启动子克隆,将其启动子序列分别命名为U1和U5。将这2个启动子片段PCR扩增后,连入含有GUS报告基因的植物表达载体Ubi-GUS,得到重组表达载体U1-GUS和U5-GUS。重组载体通过农杆菌介导法转化水稻和狗尾草,PCR筛选阳性转化苗,对阳性转化苗进行GUS染色分析,鉴定U1和U5的启动子活性。GUS染色观察发现,所有以U1和U5为启动子的水稻和狗尾草阳性转化苗的根、茎和叶均呈现较深的蓝色,比以玉米Ubi-1为启动子的阳性转化苗的蓝色略深,且以U5为启动子的阳性转化苗比以U1为启动子的蓝色更深,而非转基因的水稻和狗尾草小苗则完全染不上蓝色。因此,启动子U1和U5在水稻和狗尾草中均具有组成型强启动子的活性,可作为新的组成型启动子应用于高粱、水稻、狗尾草及其他单子叶植物的遗传转化研究。