转无机焦磷酸化酶基因甘蔗对根际土壤微生物群落多样性的影响

应用Biolog Eco微平板法研究了转无机焦磷酸化酶基因甘蔗对根际土壤微生物多样性的影响。结果表明:转基因甘蔗根际土壤微生物利用单一碳源能力(AWCD)在整个培养过程都显著高于非转基因甘蔗的根际土壤微生物;转基因甘蔗和非转基因甘蔗根际土壤样品的Simpson指数(1/D,优势度)、Shannon-Wiener指数(H,物种丰富度)、Mclntosh指数(U,物种均一性)均存在差异,其中转基因甘蔗根际土壤微生物的Simpson指数、Mclntosh指数均显著高于非转基因甘蔗土壤微生物;主成分分析也表明转基因甘蔗与非转基因甘蔗土壤微生物对不同的碳源有特异利用,起分异作用的主要碳源是糖类,其次是脂肪酸和脂类。表明转基因甘蔗根系在生长期可能诱导了具有某些特定生理特征的微生物群落的发展,因此改变了土壤微生物群落的功能多样性,总体表现较高的活性。

新台糖22号甘蔗脱毒种苗宿根性研究

本文对新台糖22号甘蔗脱毒种苗第一代种茎进行了1年新植4年宿根的田间比较试验,观察分析了田间主要农艺性状、产量和蔗糖分含量,结果表明:种植脱毒种苗可以提高新植和宿根期甘蔗蔗糖分含量和单位面积产量,但随着宿根年限的增加,增产幅度逐渐降低。分蘖率高、宿根发株率高、成茎率高是甘蔗脱毒种苗增产的主要因素。

海南蔗区甘蔗黑穗病菌生理小种鉴定

采集海南蔗区8个县市24个乡镇的甘蔗黑穗病菌样品24份,通过甘蔗黑穗病菌鉴别寄主NCO376(免疫)、NCO310(抗小种2,感小种1)、F134(感小种2,抗小种1)、F173(高感)及主栽品种ROC22,确定海南蔗区甘蔗黑穗病菌的生理小种。接种甘蔗黑穗病菌后1 a新植,2 a宿根的发病情况表明:海南蔗区甘蔗黑穗病菌生理小种为小种2,或优势小种为小种2。这对了解海南蔗区甘蔗黑穗病菌生理小种的分化及分布情况,以及对今后海南蔗区甘蔗黑穗病的防控及抗黑穗病甘蔗种质的选育提供依据。

甘蔗黑穗病菌拮抗菌HAS的筛选和鉴定

采用传统形态学鉴定及16S rRNA基因序列分析,筛选鉴定对甘蔗黑穗病菌具有拮抗作用的细菌的归属,并采用细菌的通用引物P0、P6扩增16S rRNA基因片段。结果表明:得到1 533 bp的DNA片段,其序列与枯草芽孢杆菌序列的同源性高达99%。其形态学特征:菌体为短杆状,能运动;革兰氏阳性反应;3%KOH溶解性实验呈阴性反应;有鞭毛,鞭毛周生;芽孢中生,椭圆形,孢囊稍膨大,初步将该菌株归属为枯草芽孢杆菌。与病原真菌对峙培养的结果表明,该菌对引起甘蔗和其它作物病害的多个植物病原真菌均具有很好的抑制作用。据此,可将分离的菌株HAS确定为对甘蔗黑穗病菌有较好防治效果的枯草芽孢杆菌。

转基因甘蔗植株Southern杂交体系的优化

对甘蔗Southern杂交体系的优化,旨为转基因甘蔗Southern杂交鉴定分析提供参考。以转基因甘蔗为材料,就探针不同标记方法的比较、甘蔗基因组DNA的提取、基因组DNA酶切量、酶切时间及杂交过程等方面,对地高辛标记的Southern杂交技术进行了优化研究。结果表明,改良的CTAB法提取的甘蔗DNA能满足后期实验的要求;PCR法标记探针的效率较随机引物法标记探针的效率高,更适合用于Southern杂交;40μg的DNA在400μL酶切体系中,酶切10 h可获得良好的酶切效果;杂交温度40℃,杂交18 h,可获得清晰的杂交条带。

转基因甘蔗BtG-2的T-DNA侧翼序列分析及其转化事件特异性检测

转基因甘蔗BtG-2是利用农杆菌介导法把Cry1Ac-2A-gna融合抗虫基因导入‘新台糖22号’的转基因甘蔗株系,具有良好的抗虫特性和农艺性状。为了明确转基因甘蔗BtG-2的分子特征及其检测方法,推进其生物安全性评价工作,以BtG-2的T2代为研究材料,利用Southern杂交检测外源基因在转基因甘蔗基因组内的拷贝数;利用染色体步移技术分离外源基因在甘蔗基因组中插入位点的侧翼序列,并建立了该转化体高效灵敏的特异性PCR检测方法。结果表明:Southern杂交检测证明外源T-DNA以单拷贝方式插入BtG-2株系;经过3次的热不对称巢式PCR扩增,获得外源基因T-DNA左边侧翼序列984 bp和右边侧翼序列705 bp;以这2个序列和相应的T-DNA的左右端序列分别设计3对检测引物对,建立了BtG-2株系的转化事件特异性PCR检测方法,扩增效率最高的引物对LS011/LA451和RS160/RA588分别扩增到440 bp和428 bp的特异片段。其中T-DNA左侧设计的LS011/LA451检测引物对扩增的灵敏度高、特异性强,能够在甘蔗BtG-2基因组DNA相对含量为0.1%的模板中检测出转基因目的成分,相当于9个单倍体基因组拷贝数。本研究完成了转基因株系BtG-2的分子特征及其转化事件特异性检测,为该转基因甘蔗及其衍生产品的检测和身份识别提供技术依据。

植物A20/AN1型锌指蛋白基因功能研究进展

在植物中,锌指蛋白是一类庞大的转录调控因子家族,可以通过与核酸或蛋白质结合来行使功能,参与多个生理过程。近年来研究发现,植物A20/AN1型锌指蛋白与植物的非生物逆境应答密切相关。介绍植物A20/AN1型锌指蛋白基因功能和作用机制的最新研究进展,并对植物A20/AN1锌指蛋白基因家族未来的研究趋势作出分析。

转Cry1Ac-2A-gna基因甘蔗BCG-17转化体特异性检测方法的建立

转基因作物外源T-DNA插入的侧翼序列是转基因事件检测的关键组分,也是转基因作物生物安全评价和监管所必需提供的重要信息。为了明确抗虫转基因甘蔗BCG-17的分子特征和建立其事件特异性检测方法,推进其生物安全性评价工作及未来的监管工作,以其T2代为研究材料,通过Southern 杂交检测外源基因在甘蔗基因组内的拷贝数;利用染色体步移技术分离外源基因在甘蔗基因组中插入位点的侧翼序列,并建立该转化体的高效灵敏的特异性PCR检测方法。结果表明:Southern杂交检测证明外源T-DNA以单拷贝方式插入BCG-17株系;经过3-4次的热不对称PCR扩增,分离到510 bp的T-DNA左侧翼序列和915 bp的右侧翼序列;以此为基础,分别设计左右侧翼检测引物,建立了BCG-17株系的转化事件特异性PCR检测方法,左侧翼的PCR检测方法特异性强、灵敏度高,检出极限为0.1%,相当于9个单倍体甘蔗基因组拷贝数。转基因株系BCG-17的分子特征及其转化事件特异性检测的完成,为该转基因甘蔗及其衍生产品的检测和身份识别提供了技术依据。

Cry1Ab基因转化甘蔗及转基因抗虫植株的获得

构建玉米UBI启动子驱动Bt Cry1Ab基因的高效植物表达载体pUBTB,通过农杆菌介导法导入甘蔗愈伤组织,经过除草剂PPT三次连续筛选,共获得67株抗性植株,经PCR扩增检测,得到22株阳性植株,并对其进行RT-PCR检测,证明外源基因已经成功整合到其中的15株甘蔗基因组中,且得到了有效的表达。

抗虫转基因甘蔗的培育及其抗性丧失的防控策略

由于甘蔗存在遗传背景复杂和抗虫种质资源缺乏的问题,造成甘蔗常规抗虫育种远远落后于其他作物的现状。基因工程为抗虫甘蔗的育种提供了一条崭新的途径。经过资料收集和整理并结合作者所在研究团队的研究成果,综述了近年来国内外抗虫转基因甘蔗的培育现状。首先介绍了甘蔗转基因遗传转化系统及其转基因的遗传稳定性研究的新发展,然后重点介绍了国内外在抗虫转基因甘蔗研究方面取得的突破性研究进展,尤其在通过Bt基因的改造和抗虫基因聚合等策略来防止转基因甘蔗的抗虫性下降甚至丧失等方面进行了详细的阐述,旨在为今后抗虫转基因甘蔗的育种工作提供参考。

甘蔗ShSAP1基因的启动子克隆与序列分析

启动子在转基因育种中具有重要地位,为了发掘高效的胁迫诱导和组织特异型启动子,提高目的基因的表达效率,根据甘蔗逆境相关蛋白家族基因ShSAP1的基因组序列,利用Genome Walking法对ShSAP1的启动子进行了分离,并对其序列进行了生物信息学分析。分离获得了1243 bp的启动子序列,该序列具有启动子的核心元件,还包含了干旱等胁迫相关的应答元件、MYB/MYC转录因子识别与结合元件、光应答元件及组织特异性相关元件,说明ShSAP1的启动子可能具有逆境应答及组织特异表达特性,值得开展进一步的功能研究。

一种简易的甘蔗叶组织PCR模板制备方法

以转基因甘蔗叶片为材料,少量嫩叶经碱并短暂高温处理,再中和,形成裂解混合物。直接以此为模板,转基因甘蔗外源基因bar、KP4、Cry1Ac-2A-gna融合基因及内源基因Shactin基因为靶基因,PCR扩增结果稳定、准确、重复性强,完全可以达到常规CTAB法提取的DNA扩增效果。用此方法制备的模板室温下2周之内,4℃、-20℃下一个月之内结果不变。经多种外源基因PCR反应的反复验证,证实了这种方法在转基因甘蔗检测中的广泛适用性。该方法快速制备PCR模板,无需DNA提取过程,具有使用样品量少,成本低、简便、快捷等优点。

抗虫转基因甘蔗对土壤酶活性的影响

为了评价抗虫转基因甘蔗优良株系Bt2、Bt17对土壤生态环境造成的生态安全风险,采集抗虫转基因甘蔗Bt2、Bt17号株系及其受体非转基因品种ROC22甘蔗根际附近土壤,研究抗虫转基因甘蔗对其根际土壤蔗糖酶、酸性磷酸酶、中性磷酸酶及碱性磷酸酶的影响。结果表明,抗虫转基因甘蔗对其根际土壤酶活性的影响会因甘蔗生长周期、抗虫转基因甘蔗株系以及酶的种类而大有不同。Bt2的土壤酶活性在甘蔗生长的各个时期均未与对照存在差异,而Bt17对土壤酶活性的影响则较为复杂。与受体非转基因甘蔗品种ROC22相比,Bt17根际的土壤蔗糖酶活性在甘蔗生长的任何时期都无差异;而土壤酸性磷酸酶活性在甘蔗生长的各个时期均显著高于对照;中性磷酸酶活性则在苗期、分蘖期、成熟期显著高出对照,而在生长期与对照无差异;土壤碱性磷酸酶活性在苗期、生长期时与对照无差异,但分蘖期和成熟期显著低于对照,说明Bt2号株系对土壤酶活性并未产生影响,Bt17号株系对土壤酶活性可能产生较小的影响。

保水剂在海南春植蔗上的应用效果研究

通过大田试验方法,研究了保水剂的吸水特性及不同用量保水剂对海南春植蔗的影响。结果表明:施用保水剂30.0、37.5、45.0kg/hm2能够提高甘蔗出苗率和分蘖率,促进甘蔗的生长,增加有效茎数;施用保水剂22.5 kg/hm2效果与不施用保水剂相似,差异不显著;施用保水剂37.5 kg/hm2效果和施用保水剂45.0 kg/hm2效果相似,从经济上考虑,施用保水剂37.5 kg/hm2对海南春植蔗的抗旱效果最好。

甘蔗锌指蛋白基因ShSAP1表达产物的亚细胞定位

甘蔗锌指蛋白ShSAP1可能参与了甘蔗成熟与逆境应答的过程。为了研究ShSAP1的功能,可通过亚细胞定位研究ShSAP1的定位特点。首先将ShSAP1基因的编码区序列连接到植物表达载体pCAMBIA1302中,构建ShSAP1与绿色荧光蛋白基因融合的植物表达载体pCAMBIA-ShSAP1,然后采用基因枪转化法转入洋葱表皮细胞,在荧光显微镜下观察ShSAP1与GFP融合表达产物在洋葱表皮细胞中的亚细胞定位,结果表明ShSAP1-GFP融合蛋白定位在细胞膜、细胞质和细胞核中。

甘蔗褐条病病原菌分离鉴定及其室内毒力的测定

针对海南省不同植蔗区甘蔗褐条病的典型病斑进行分离培养、单孢纯化、形态学观察、致病性检测以及结合r DNA-ITS序列分析鉴定病原菌。分离到的5株病原菌,经回接实验表明,病原菌HT-4致病性最强,能引起与田间病害一致的症状,将菌株HT-4的r DNA-ITS序列在NCBI上进行BLAST比对。结果表明:菌株HT-4与离蠕孢属(Bipolaris)相似性达到99%,结合形态学分析确定该菌是甘蔗褐条病的病原菌。室内毒力实验表明:在7种供试药剂中,50%咪鲜胺锰盐和10%苯醚甲环唑对病原菌抑制效果最好,EC50值分别为4.400 6 mg/L和9.421 1 mg/L。结果为甘蔗褐条病的防控提供科学参考。

一株拮抗香蕉枯萎病菌的细菌HN-1的鉴定和拮抗作用的测定

在香蕉枯萎病园区中,从土壤中分离获得一株细菌HN-1,并进行对峙培养、孢子萌发抑制测定。结果表明:HN-1对香蕉枯萎病菌的菌丝生长、孢子萌发具有良好的抑制效果。经形态特征、生理生化特征和16SrDNA序列测定和分析,将HN-1鉴定为短短芽孢杆菌(Brevibacillus brevis)。与病原真菌对峙培养的结果表明,该菌株对供试的15种植物病原真菌均有很好的抑制作用。

抗真菌KP4蛋白的原核表达载体构建与表达

为制备KP4的多克隆抗体,将KP4编码框克隆到pMD19-T中,载体经测序后,亚克隆到原核表达载体pET32a中,获得了KP4的原核表达载体PET-KP4。将构建成功的KP4原核表达载体转化宿主菌BL21(DE3)并用IPTG对重组菌进行诱导表达,SDS-PAGE电泳分析诱导后重组菌的总蛋白显示,融合蛋白大小约为31 ku,以包涵体形式存在;对融合蛋白的表达条件进行了优化,KP4大量表达最佳培养温度为37℃,诱导剂IPTG的最佳浓度为1.0 mmol/L,最佳诱导培养时间为8 h;对目标蛋白进行包涵体破碎,用Ni2+-NTA琼脂糖亲和层析对总蛋白进行了纯化。SDS-PAGE电泳分析与蛋白浓度测定结果显示,目的蛋白纯度好,浓度达到了236μg/mL。

甘蔗锌指蛋白基因ShSAP1的克隆与表达模式

植物中具有A20/AN1锌指结构域的蛋白与逆境应答密切相关,在甘蔗热带种Saccharum officinarum拔地拉Badila中克隆到一个具有A20/AN1锌指结构域的锌指蛋白基因ShSAP1。为研究ShSAP1的基因结构和表达特性,采用PCR和Southern blotting分析了ShSAP1的基因组结构,通过半定量RT-PCR对ShSAP1在甘蔗不同部位、不同胁迫和不同激素处理下的表达模式进行了分析。结果表明,ShSAP1的5＇UTR区有两段内含子,大小分别为202 bp和1 052 bp,在Badila中有1~2个拷贝;ShSAP1在甘蔗成熟植株根茎叶中均有表达,在茎秆中的表达量随着茎节成熟而递增;在幼苗阶段,ShSAP1的表达能被高盐、模拟干旱、GA3、ABA和ET诱导增强。以上结果表明,ShSAP1可能在甘蔗成熟与逆境应答中具有重要作用。

作物抗旱性及抗旱育种研究进展

干旱胁迫严重影响着作物生长发育。主要从作物形态、渗透调节、光合作用、细胞膜及其结构的保护机制、干旱传感和信号转导、转录因子以及干旱诱导蛋白等方面对作物抗旱生理及其分子机制研究进展进行概述。以及对传统抗旱育种和现代分子抗旱育种作一简要概述。以期为我国抗旱农业研究与抗旱育种提供一些思路。