基于RNAi和蛋白质组学研究胶孢炭疽菌CgCDC2基因的功能

【目的】CDC2是调控细胞周期的主要因子之一,对植物病原菌的生长发育有着重要作用,但目前还未有胶孢炭疽菌CDC2蛋白生物学功能方面的研究。本试验的目的是获得胶孢炭疽菌(Colletotrichum gloeosporioides)CgCDC2的RNAi突变体菌株,并分析CgCDC2基因的功能。【方法】利用RNAi技术和PEG介导法获得CgCDC2的RNAi突变体菌株,通过表型分析、TMT蛋白质组学分析和酶活性测定来确定该基因的生物学功能。【结果】通过PCR扩增获得CgCDC2基因,编码一个326个氨基酸的蛋白,其RNAi突变体菌株与野生型相比,生长速率减缓、分生孢子产量显著下降、对H2O2敏感性增强,PG、PL蛋白质含量、基因相对表达量和酶活性均显著降低,致病力减弱。【结论】CgCDC2参与调控胶孢炭疽菌的生长,分生孢子产量,氧化应激反应以及PG、PL的酶活性,从而降低病原菌的致病力。

杧果蒂腐病研究进展

杧果蒂腐病是杧果最严重的采后病害之一,主要为害杧果果实,一般在贮藏及贮运期间常引起杧果果实腐烂,降低其经济和食用价值。杧果蒂腐病由多种病原菌引起,且其病原菌多样。本文论述了三种常见的杧果蒂腐病(球二孢属蒂腐病、小穴壳属蒂腐病、拟茎点霉属蒂腐病)的发生史、病原菌、症状与危害、发病规律、致病机制及综合防治等方面的内容,为蒂腐病的研究与防治提供参考。

漆酶基因Cglac10的缺失对杧果炭疽病菌无性繁殖和侵染能力的影响

【目的】揭示漆酶基因Cglac10在杧果炭疽病菌(Colletotrichum gloeosporioides)生长及侵染致病过程中的功能。【方法】利用qPCR技术对Cglac10在该菌侵染过程中的表达进行分析,并通过同源重组和PEG介导的原生质体转化法获得敲除突变体ΔCglac10H和回复菌株C-ΔCglac10H。【结果】Cglac10基因在侵染过程中的表达量是侵染前的8.02~13.66倍。回复菌株C-ΔCglac10H的表型与野生型菌株的无显著差异;突变体ΔCglac10H除在菌丝生长速率方面与野生型菌株差异不明显外,菌落颜色变为白色,培养10 d时菌丝中黑色素含量下降了67.33%,产孢量显著下降;在水膜中培养至24 h时,ΔCglac10H才偶见形成附着胞,36 h时的形成率仅为野生型菌株的44.85%;在PDB中培养6 d后,ΔCglac10H的胞内漆酶活性较野生型菌株下降了57.61%;不刺伤时,ΔCglac10H几乎不致病,刺伤接种6 d后,观察到ΔCglac10H的致病力比野生型菌株下降了52.94%。【结论】Cglac10在C.gloeosporioides无性繁殖及侵染致病过程中起着重要作用。

杧果钙调蛋白转录激活因子基因家族的鉴定及分析

【目的】鉴定杧果钙调蛋白转录激活因子(CAMTA)基因家族成员并对其进行生物信息学分析,探究杧果在抵抗病原菌侵染和响应水杨酸、茉莉酸抗病信号分子时的持续表达特性。【方法】利用生物信息学方法在杧果全基因组中鉴定MiCAMTA转录因子基因,并对其理化性质、保守基序、保守结构域进行分析;利用MEGA软件构建系统发育树,分析MiCAMTA蛋白与拟南芥、烟草、毛果杨等5个物种CAMTA蛋白的系统发育关系;通过实时荧光定量PCR分析MiCAMTAs在不同病原菌侵染和抗病信号分子处理下的表达差异。【结果】MiCAMTAs都属于亲水性不稳定蛋白,且均具有较高保守性;系统发育进化树显示,MiCAMTAs与苹果、毛果杨、烟草的亲缘关系较近,且保守基序及保守结构域相似的蛋白聚类在同一组中。qRT-PCR显示,MiCAMTAs不同程度地参与了病原菌侵染和抗病信号分子的诱导,在(Colletotrichum gloeosporioides,Cg)侵染过程中,MiCAMTA(1、2、3)表现为下调,而(Xanthomonas citri pv.mangiferaeindicae,Xcm)侵染下表达量呈明显上调趋势,与此同时,也发现MiCAMTA(5、6、7、8)在Cg和Xcm侵染下表达量都呈现上调趋势;在不同激素(SA、MeJA)处理中,MiCAMTAs均有不同程度的上调或下调,MiCAMTA6和MiCAMTA7在SA处理后72 h内呈上调表达。另外,来自同一组的MiCAMTA基因在胁迫下表现出相似的表达模式。【结论】杧果全基因组中有8个MiCAMTA家族成员,具有典型的CaM结合结构域,包含了10个motifs,能不同程度地被病原菌和抗病信号分子激活。

外源物对杧果胶孢炭疽病菌漆酶活性及漆酶基因家族成员表达的作用

【目的】为了揭示杧果胶孢炭疽病菌(Colletotrichum gloeosporioides)漆酶基因家族成员在转录水平上响应无机阴阳离子和有机物类型外源物的表达模式,为探究该家族在C.gloeosporioides侵染中的作用和开发潜在杀菌剂靶标提供参考。【方法】测定了27种外源物对杧果胶孢炭疽病菌胞外漆酶酶活性的影响,以及4种代表性外源物对胞内漆酶酶活性、黑色素产量和附着胞形成率的影响,同时利用实时荧光定量PCR(real-time quantitative PCR,qRT-PCR)分析了4种代表性外源物对13个漆酶基因家族成员表达的调控。【结果】对杧果胶孢炭疽病菌胞外漆酶活性具有明显抑制作用的有Fe^(2+)、Fe^(3+)、NH_(4)^(+)、Na^(+)、K^(+)、SO_(3)^(2-)、CO_(3)^(2-)、HCO_(3)^(-)、SO_(4)^(2-)、NO_(3)^(-)、H_(2)PO_(4)^(-)、HPO_(4)^(2-)、半胱氨酸、白藜芦醇、对甲氧基苯胺、对羟基苯甲酸、二甲基亚砜、肉桂酸和香草酸,其中Fe^(2+)、Fe^(3+)、SO_(3)^(2-)和半胱氨酸的抑制作用为90%,尤为明显;3个浓度的Ca^(2+)均促进,Mn^(2+)、Cu^(2+)、Zn^(2+)和Mg^(2+)在1 mmol·L^(-1)时促进,5、10 mmol·L^(-1)时抑制;4-羟基-3-甲氧基肉桂酸甲酯和焦性没食子酸在1、5 mmol·L^(-1)时抑制,在10 mmol·L^(-1)时明显促进。从对胞内漆酶酶活性和附着胞形成率影响来看,1 mmol·L^(-1)的Cu^(2+)和Mn^(2+)促进,1 mmol·L^(-1)的SO_(3)^(2-)和半胱氨酸抑制。从对黑色素合成影响来看,1 mmol·L^(-1)的Cu^(2+)显著促进,但1 mmol·L^(-1)的Mn^(2+)和SO_(3)^(2-)和半胱氨酸无显著影响。qRT-PCR结果显示,1 mmol·L^(-1)的Cu^(2+)对约3/4的漆酶基因家族成员诱导表达,但抑制Cglac11和Cglac12的表达;Mn^(2+)、SO_(3)^(2-)和半胱氨酸对约1/3的成员起促进作用,对23%的成员抑制表达,不影响其余成员的调控;4种外源物均显著促进Cglac2的表达但均不影响Cglac3的表达。【结论】不同外源物对杧果胶孢炭疽病菌漆酶活性、黑色素合成和附着胞的形成以及对漆酶基因家族成员的表达调控影响有差异,初步推测Cglac2、Cglac12和Cglac13与外源物Cu^(2+)、Mn^(2+)、SO_(3)^(2-)和半胱氨酸之间存在密切关系。