解淀粉芽孢杆菌TWC2诱导甘蔗抗病性相关防御酶系的研究

为了探讨解淀粉芽孢杆菌TWC2诱导甘蔗抗病性机理,开发有效的生防制剂,采用比色法测定了解淀粉芽孢杆菌TWC2诱导甘蔗叶片后对叶片中多酚氧化酶(PPO)、过氧化物酶(POD)、苯丙氨酸解氨酶(PAL)、超氧化物岐化酶(SOD)、过氧化氢酶(CAT)5种防御酶活性及丙二醛(MDA)含量的影响。结果表明,解淀粉芽孢杆菌TWC2处理后的甘蔗叶片CAT、POD、SOD、PAL、PPO比未处理的显著提高;MDA含量比未处理的显著降低;且经10倍稀释液处理的甘蔗叶片中防御酶活性最高,诱导植株抗病性效果最佳。喷施TWC2稀释液可促使甘蔗抗病相关酶活性升高,诱导甘蔗植株产生系统抗性。诱导抗性可能是TWC2防治甘蔗病害的重要机制之一。

甘蔗黑穗病菌和赤腐病菌双重PCR检测体系的建立

目前,针对甘蔗黑穗病菌与赤腐病菌单个病菌检测体系已相继建立,但是仍然未见两个病原菌的双重PCR检测方法。在本研究中,根据黑穗病菌交配型b E基因、甘蔗赤腐病菌特异性SCAR片段序列的特异性引物,在二者单一PCR检测体系的基础上,建立并优化可同时检测黑穗病菌和赤腐病菌的双重PCR检测方法。建立的双重PCR检测体系可从黑穗病菌与赤腐病菌样品中分别扩增出320 bp和442 bp的特异条带。灵敏度分析结果表明,对混合模板黑穗病菌与赤腐病菌的最低检测水平量均为0.1ng。

甘蔗赤腐病菌拮抗细菌TWC2的分离鉴定及其防效研究

由镰孢炭疽菌(Colletotrichum falcatum Went)引起的赤腐病是甘蔗生产上的主要病害之一,发病时可导致甘蔗产量严重损失。为探求赤腐病有效的生防措施,从热带牧草台湾草叶片上分离到一株生防菌TWC2。经形态观察、16S r DNA序列分析和生理生化鉴定,确定为解淀粉芽孢杆菌(Bacillus amyloliquefaciens)。平板对峙试验结果发现,TWC2菌株对甘蔗赤腐病菌(Colletotrichum falcatum)、香蕉黑星病菌(Macrophoma musae)、橡胶树炭疽病菌(Colletotrichum gloeosporioides)、柱花草炭疽病菌(Colletotrichum gloeosporioides)、芒果炭疽病菌(Colletotrichum gloeosporioides)、甘蔗环斑病菌(Leptosphaeria sacchari)、王草茎点霉叶斑病菌(Phoma herbarum)、西瓜枯萎病菌(Fusarium oxysporum)等病原菌均具有一定的抑制作用。离体叶片接种试验发现,TWC2菌株对甘蔗赤腐病菌的抑制率达72.01%,盆栽试验与离体叶片接种结果一致,表明TWC2菌株对甘蔗赤腐病具有较好的防治效果。该结论为开发甘蔗赤腐病生防方法打下了基础。

甘蔗褐锈病菌巢式PCR分子检测方法的建立

为建立甘蔗褐锈病菌巢式PCR分子检测方法,本研究利用真菌DNA内源转录间隔区通用引物ITS1/ITS4扩增甘蔗黑顶柄锈菌DNA,并对其扩增产物进行克隆测序,获得序列于NCBI网站进行比对分析,并于该序列多态性丰富区域设计了2对引物PM2F/R、PM3F/R。通过对同寄主不同病原菌、以及不同属的锈菌DNA进行PCR检测以验证引物的特异性。结果表明,在优化的单一PCR反应体系与程序条件下,2对引物均仅能从甘蔗黑顶柄锈菌中扩增出约474 bp和363 bp的特异条带,而从其它真菌DNA中均扩增不出任何条带。进一步将引物PM2F/R作为第一轮扩增引物、PM3F/R作为第二轮扩增引物进行巢式PCR扩增后,其检测灵敏度在DNA水平上可达0.001 ng/μL,较常规PCR提高100倍。由此表明,依据本研究所设计的2对引物而建立的快速、灵敏、准确的甘蔗黑顶柄锈菌的检测技术,对病原菌的早期诊断、快速检测及病害流行学研究具有重要意义。

王草茎点霉叶斑病病原鉴定及生物学特性

针对在广西横县发生的一种王草叶斑病害,为明确其病原种类,采用形态学和分子生物学方法进行了鉴定,并研究其生物学特性。结合致病菌的形态特征以及ITS序列系统聚类分析结果,将其鉴定为草茎点霉(Phoma herbarum)。生物学特性研究表明:该菌菌丝体适宜生长的温度为20~32℃,最适温度为25~28℃;菌丝体生长的最适p H值为5~8;菌丝体生长的最佳碳源为葡萄糖、蔗糖和甘露醇;最佳氮源为蛋白胨,而尿素则不适合菌丝体生长;光/暗交替或暗/光交替均有利于菌丝体生长;菌丝体致死温度为50℃,10 min。

假臭草植株不同分解阶段的化感作用动态变化

以小白菜为生测对象,采用滤纸培养皿试验和盆栽试验研究了自然状态下假臭草植株分解过程中化感作用的变化动态。滤纸培养皿试验结果表明:假臭草植株提取液对小白菜种子发芽的抑制作用随浓度增大而增大,且随植株分解时间的延长而逐渐减弱;就幼苗根长而言,不同分解时期0.1g·mL-l的假臭草提取液对根长均表现为抑制作用,除未分解的假臭草以外,其他时期其他浓度的假臭草提取液对根系生长均有促进作用;假臭草提取液对小白菜茎长总体表现为促进作用。假臭草与土壤混合的盆栽试验显示,未分解的假臭草与土壤以50g·2kg-1比例混合对小白菜种子发芽有抑制作用,抑制率达68%,在土壤中分解10d后抑制作用消失;各时期假臭草对小白菜生物量均有显著提高作用。可见,假臭草作为绿肥具有较好的营养价值,但需依据其在不同生长时期对不同作物的化感作用强度和时间设置合理的施用量与施用方法。

生防菌TB2对甘蔗叶片抗病相关酶活的诱导作用

以多酚氧化酶(PPO)、过氧化物酶(POD)、超氧化物歧化酶(SOD)、苯丙氨酸解氨酶(PAL)和过氧化氢酶(CAT)等5种防御酶作为植物抗病性反应指标,研究生防菌TB2和甘蔗赤腐病病菌对甘蔗植株抗病相关酶的影响。结果表明,先接病原菌后喷施生防菌TB2、先喷施生防菌后接病原菌、病原菌处理、生防菌处理等处理后,与植物防御抗病相关的PPO、POD、SOD、PAL、CAT防御酶活性均比对照组高,表明TB2和赤腐病菌均能诱导甘蔗叶片中的防御酶活性增强;先喷施生防菌后接病原菌的防御酶活性比同期先接病原菌后喷施生防菌的高,说明TB2诱导能力强于赤腐病菌。两者共同处理的甘蔗叶片中5种防御酶活性高于单独处理。可见TB2和赤腐病菌共同诱导具有协同增效作用。

解淀粉芽胞杆菌JNC2摇瓶发酵条件优化

以菌体量和发酵滤液抑制柱花草炭疽病菌(Colletotrichum gloeosporioides)活性为指标,通过单因素和正交试验方法对解淀粉芽孢杆菌(Bacillus amyloliquefaciens)JNC2菌株的最适发酵培养基成分及发酵条件进行研究。结果表明:JNC2菌株最佳培养基为木糖2%,蛋白胨0.4%,酵母粉0.8%,氯化铵0.6%,硫酸镁0.2%;最佳发酵条件为初始pH 6.0,250 mL三角瓶装液量为60 mL,接种量体积分数7%,发酵温度34℃,转速200 r·min^–1,发酵时间72 h,优化后发酵滤液的抑菌活性显著提高了32.61%。

剑麻斑马纹病菌5个多聚半乳糖醛酸酶基因的克隆与序列分析

以寄生疫霉菌多聚半乳糖醛酸酶pppg1～pppg5等5个基因c DNA序列为参考,设计基因编码区特异性引物。利用5对引物分别对剑麻斑马纹病菌进行分子检测以及基因同源克隆。通过此方法首次从剑麻斑马纹病菌中获得了5个多聚半乳糖醛酸酶基因,并分别命名为Szpg1～Szpg5。检测结果表明,Szpg1～Szpg5基因普遍存在于被检测剑麻斑马纹病菌中。序列分析结果表明,Szpg1～Szpg5基因与pppg1～pppg5对应基因之间存在核苷酸序列差异,由此导致个别氨基酸的差异,甚至提前终止。由此推测,Szpg1～Szpg5基因与pppg1～pppg5在功能上可能存在着一定的差异。

11种杀菌剂对甘蔗赤腐病菌的毒力测定

由镰孢炭疽菌（Colletotrichum falcatum Went.）引起的甘蔗赤腐病是甘蔗上最具毁灭性的病害之一,在病害流行季节能导致严重的产量损失。为了解甘蔗赤腐病原对杀菌剂的敏感性,本研究测定了11种杀菌剂对该病原菌的毒力。结果表明,11种杀菌剂对甘蔗赤腐病菌的毒力存在明显差异。其中,戊唑醇、丙环唑、咪酰胺、苯醚甲环唑、多菌灵等5种药剂对甘蔗赤腐病菌菌丝体生长具有较好的抑制作用,EC50值介于0.227-0.818μg/mL。其对应EC95值也都小于12μg/mL,介于1.416-11.339μg/mL。就敏感性而言,4株赤腐病菌菌株对多菌灵的b值在11种杀菌剂中均为最大。由此表明,甘蔗赤腐病菌对多菌灵的剂量反应变化比其它几种杀菌剂均要敏感。

剑麻茎腐病菌基因组SSR标记开发

下载 Aspergillus niger ATCC 1015菌株全基因组序列，利用GRAMENE网站提供的SSR鉴定工具SSRIT（Simple Sequence Repeat Identification Tool），并按含有2～10个碱基重复、碱基数在18bp以上的SSR基元为标准进行SSR鉴定。结果从A．niger ATCC1015全基因组中．共发现4000个2～10碱基SSR．其中含9个碱基重复基元类型最多．共有1433个．占所鉴定SSR总数的35．8％。其次为6个碱基重复基元类型，共有753个，占SSR总数的18．8％；接着为3个碱基重复类型，共有547个，占13．6％。从鉴定出来的SSR中，选择含有SSR的合适区段．从中设计了36对引物．对剑麻茎腐病菌17个菌株的基因组DNA进行了PCR检测，发现这些引物都能从剑麻茎腐病菌基因组DNA中有效扩增。由此表明．黑曲霉ATCC1015菌株基因组SSR在剑麻茎腐病菌基因组中具有通用性。这为研究剑麻茎腐病菌群体遗传变异、多样性和进化，定位和克隆功能基因等提供了分子标记．

咖啡叶锈病菌转录组SSR信息分析

咖啡叶锈病是咖啡一种毁灭性病害。利用GRAMENE网站提供的SSR鉴定工具SSRIT（Simple Sequence Repeat Identification Tool）,对咖啡叶锈病菌8 310条无冗余的EST分别进行SSR鉴定。结果共搜查到1 292个1~6碱基SSR,出现频率最高的为三碱基重复基元类型,其次为二碱基重复基元类型与六碱基重复基元类型。分别为459、321与214个,其出现频率分别为35.5%、24.8%与16.6%。AT/AT为二核苷酸中优势重复类型,占其总数的49.8%;而ATC/ATG与AAG/CTT则为三核苷酸中优势重复类型,二者分别占三核苷酸SSR总数的23.5%与23.3%。进一步对SSR多态性进行了预测,从而筛选出长度在22 bp以上具有潜在多态性的SSR 223个。此结果对于咖啡叶锈病菌群体遗传变异、多样性和进化等研究提供了分子标记。

桂牧1号杂交象草叶斑病病原鉴定及其生物学特性分析

从儋州牧草种质中心资源圃的桂牧叶斑病叶片上分离得到一株致病真菌,通过采用形态学观察、致病性测定、分子生物学等鉴定方法对该致病菌进行了研究。结果表明,菌丝体表面光滑,有横隔,分生孢子呈球棒形或长纺锤形,淡褐色至中等褐色,端部钝圆,基部有明显突出的脐点,有3-12个隔膜,大小约（71.22-76.97）μm×（3.54-6.16）μm。其型态特征与蠕孢属（Exserohilum sp.）描述高度相符。对其核糖体DNA内转录间隔区（ITS）序列进行PCR扩增、测序获得长度为602 bp的序列,经BLAST比对,该序列与嘴突凸脐蠕孢（Exserohilum rostratum）ITS序列同源性达99%。结合致病菌的形态特征和ITS序列分析结果,将其鉴定为嘴突凸脐蠕孢。经生物学特性研究发现：适宜该菌菌丝体生长的温度为25-32℃,最适温度为28-32℃;菌丝体生长的最适p H为6-8;菌丝体生长的最佳碳源为葡萄糖、蔗糖和甘露醇;最佳氮源为硝酸钠,尿素不适合菌丝体生长;全黑暗条件有利于菌丝体生长;菌丝体致死温度为55℃,10 min。杀菌剂室内毒力测定结果显示：对嘴突凸脐蠕孢毒力最强的杀菌剂为咪鲜胺和苯醚甲环唑,EC50分别为0.007 1 mg/L和0.007 2 mg/L;嘴突凸脐蠕孢对戊唑醇最敏感。