有机磷农药乐果降解菌株L3的分离鉴定及其性质的初步研究

从常年施用农药乐果的土壤中,通过富集培养和平板稀释法,分离得到一株具有较强降解有机磷农药乐果能力的真菌菌株L3,通过形态观察及真菌的ITS检测,对其进行了鉴定,同时对其性质进行了初步研究。结果表明,该菌株为Aspergillus nomius。是以共代谢方式降解乐果的。在查氏培养基中最高能耐受6 000 mg.L-1的乐果;在28℃、pH6.0的条件下生长较好,120 h对乐果的降解率达29.2%,并且对其他有机磷农药也有较好的降解作用,120 h对乙酰甲胺磷和辛硫磷的降解率分别达65.9%和95.3%,初步确定菌株L3对有机磷农药的降解有一定的广谱性。

爪哇正青霉Q-5产几丁质酶发酵条件的研究

通过单因素试验对爪哇正青霉Q-5产几丁质酶的条件进行了研究。结果表明:0.5%(w/v)几丁质粉末对爪哇正青霉Q-5产几丁质酶诱导性最强;pH值在5.0～7.0的范围内酶活力最稳定,pH值为4.0时,酶活力最低;金属离子Mn2+和Cu2+对爪哇正青霉Q-5产几丁质酶有明显的促进作用,而Fe3+和Ca2+则完全抑制几丁质酶的活性;以蛋白胨为氮源时,酶的活力最高可达24 U;吐温-80作为表面活性剂能显著提高几丁质酶活性。

Metarhizium anisopliae var.anisopliae Pr1A基因的克隆表达及抗血清研究

采用RT-PCR方法从本实验室分离筛选到的金龟子绿僵小孢变种Metarhizium anisopliae vat．anisopliae中,扩增得到PrlA基因全长,此基因全长为1242bp,经Blastn分析此基因序列与M．anopliae的PrlA基因(M73795)同源率为98%。以pET- 22b(+)为基础载体,构建pET-PrlA重组表达载体,在大肠杆菌(Escherichia．coli)BL 21(DE3)中进行表达。经SDS—PAGE分析,获得了约42kDa大小的重组目的蛋白,目的蛋白占表达总蛋白含量的63．2%。将表达的PrlA蛋白切胶回收后制备成抗原,免疫家兔4次后,采血收集抗血清,用ELISA测定效价为1/10000。结果表明,获得的抗体可用于更进一步的研究,将有利于我们进一步了解M．anisopliaeis的侵染机理,弄清楚各Pr蛋白酶的作用方式和对寄主的选择优势,提高生防控制的有效性。

椰心叶甲CYP4基因的克隆及绿僵菌侵染后的诱导表达研究

根据细胞色素P450家族4(CYP4)的氨基酸保守序列设计1对简并引物,从椰心叶甲Brontispalongissima成虫总RNA中扩增得到5个cDNA片段(GenBank登录号:DQ238840-DQ238844)。以3′-RACE法获得片段BLWH4的3′端序列,推导的氨基酸序列表明其结构中含有CYP家族的特征性保守序列:螺旋K区的ETLR和血红素结合区的F××G×××C×G。以18S为对照的RT-PCR分析表明,BLWH4在成虫的mRNA表达量远大于幼虫。绿僵菌Metarhiziumanisopliae菌株MA-3和MA-4侵染椰心叶甲成虫及5龄幼虫后,BLWH4的mRNA表达增强,提示BLWH4可能具有增强椰心叶甲抵抗绿僵菌侵染的作用。

香蕉炭疽菌rDNA ITS区的分子鉴定与检测

香蕉炭疽病菌(Colletotrichum musae)是一种引起香蕉采后病害的最重要病原,本研究用真菌18S^28S间的内转录间隔区(internal transcribed spacer,ITS)通用引物18SF和28SR扩增香蕉炭疽菌和其它外群真菌的基因组DNA,扩增出约510 bp的片段;通过克隆测序香蕉炭疽菌的ITS全序列并与GenBank中炭疽菌属其它种的ITS序列比对,设计出香蕉炭疽菌的特异性引物ColM1和ColM2。用此特异引物可以从香蕉炭疽菌株中扩增出382 bp的特异性片段,而其余20个参试菌株和香蕉组织的PCR反应结果为阴性,灵敏度实验证明可以检测到目标DNA的浓度为0.1 pg。该方法可用于快速、准确和灵敏地检测香蕉炭疽菌,为快速监测组织中有无香蕉炭疽病菌潜伏侵染与及早采取防治措施提供积极的指导意义。

发酵条件对拟青霉E7菌株产脱乙酰几丁质酶的影响

以脱乙酰几丁质为惟一碳源和氮源,通过平板透明圈筛选法,从土壤中筛选分离了30株产脱乙酰几丁质酶的菌株,根据产生透明圈的大小和酶活测定,从中选出产脱乙酰几丁质酶活力最高的拟青霉E7菌株进行产酶发酵条件的进一步研究。结果表明,0.5%￣1%的脱乙酰几丁质浓度有利于产酶,高于2%则对其产酶有抑制作用;金属离子对酶活力有一定的影响,在基本培养基中添加Mn2+对产酶有较强的诱导作用,而加入Ca2+则对产酶有一定的抑制作用;以蛋白胨为氮源时,产酶活力最高,可达到60U·mL-1;pH对E7菌株的产酶活力影响较大,方差分析表明,不同pH值的产酶活力存在显著差异(a=5%),pH在4.0￣6.0范围内酶活力较稳定,pH高于6.0酶活力很低,不利于产酶。

椰心叶甲ITS、5.8S rDNA序列分析

利用PCR和DNA测序技术,克隆了椰心叶甲的内转录间隔区ITS及5.8S rDNA序列,其全长为2 107 bp,并对这一序列进行了详细的分析,为研究椰心叶甲地理种群的差异及其不同类群之间的遗传关系,并重构椰心叶甲从原产地到各受灾地区的传播路线等方面奠定了分子基础,对制定椰心叶甲的综合防治策略具有指导意义。

绿僵菌防治椰心叶甲的毒力菌株筛选

在室内用绿僵菌的分生孢子悬浮液喷洒椰心叶甲成虫和幼虫,检测了不同来源的21株绿僵菌菌株对椰心叶甲的致病力。初步试验结果表明,A类菌株中的MA2、MA4和MA9,B类菌株中的MB2、MB4、MB5、MB6和MB7等对椰心叶甲的成虫和幼虫均具有较理想的效果,处理5天后成虫和幼虫的平均僵死率可达95%以上。但由于A类菌株比B类菌株产孢快、孢子量多,所以对A类菌株的MA2、MA4和MA9菌株再做进一步的室内毒力试验。最终结果表明,MA4菌株对椰心叶甲的毒力相对是最高的,具有较大的开发利用价值。

金龟子绿僵菌(Metarhizium anisopliae HN1)几丁质酶基因的克隆及高效表达

几丁质酶是昆虫病原真菌金龟子绿僵菌致病力的主要因子之一。用RT-PCR方法,从分离筛选到的高毒力金龟子绿僵菌Metarhizium anisopliae伽HN1中,扩增得到几丁质酶基因全长,此基因全长为1275bp,登录号为DQ011865,经Blastn分析此基因序列与M.anisopliae E6的chi1基因(AFD2749)同源率为96％。以pET-22b(+)为基础载体,构建pET-chi重组表达载体,在大肠杆菌(Escherichia coli)BL 21中进行表达。经SDS-PAGE分析,获得了42kDa大小的重组目的蛋白,目的蛋白占表达总蛋白含量的63．3％。菌体经冷冻与超声波破碎后,按DNS法可测得几丁质酶的活性。

香蕉枯萎病菌Fow1基因的克隆及序列分析

为了解Fow1基因在尖镰刀菌古巴专化型侵染香蕉过程中的作用,及其与尖镰刀菌古巴专化型生理小种1号和生理小种4号之间的致病力差异的关系,采用PCR和RT-PCR方法扩增了2个生理小种的Fow1基因,并对扩增产物进行了克隆测序及相似序列搜索和比对,还对基因编码的蛋白进行了结构预测和功能分析。研究结果表明2个生理小种Fow1基因开放阅读框均为957bp,编码318个氨基酸,基因序列和氨基酸序列差异小,而且两个生理小种Fow1基因所编码的蛋白均具有酵母线粒体载体蛋白典型的结构特征,推测Fow1基因可能为香蕉枯萎病菌在香蕉组织中定殖所必需。从Fow1基因序列及其编码蛋白的氨基酸序列看,2个生理小种致病力的差异与Fow1基因并无明显对应关系,这为进一步研究Fow1基因功能奠定了基础。

群体感应机制在生防细菌筛选中的应用

根据群体感应机制,利用PCR技术,摸索出一套能够高效筛选生防细菌的方法。利用这一方法,从土壤中分离的1 399株细菌中筛出42株,占总分离株的3%,PDA培养基平板拮抗试验发现,其中有39株对香蕉尖孢镰刀菌有抑菌效果,占总筛选株数的95.2%。抑菌效果最好的分离株DFL059在田间试验中对香蕉枯萎病有较强的生防效果。

绿僵菌侵染对椰心叶甲酚氧化酶活性的影响

对椰心叶甲Brontispa longissima(Gestro)成虫血淋巴中酚氧化酶的特性进行分析,并研究绿僵菌(Metarhizium anisopliae)侵染对血浆甲酚氧化酶活性的影响。结果显示,椰心叶甲成虫的血浆及血细胞裂解液中均检测到酚氧化酶活性,且昆布多糖及胰蛋白酶可显著提高其活性。绿僵菌MA-4侵染组在侵染后第1至第5d的血浆酚氧化酶活性高于未侵染组(P<0.05),但是椰心叶甲成虫体内注射10μg昆布多糖后,侵染组的酚氧化酶活性显著低于未侵染组(P<0.05),表明绿僵菌一方面对可激活椰心叶甲的酚氧化酶原激活系统,另一方面又可抑制昆布多糖对椰心叶甲酚氧化酶原激活系统的诱导作用。