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抗人SARS病毒单链抗体库的构建 被引量:4
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作者 赵爱志 彭建强 +4 位作者 曹晖 康禹 崔莲仙 吴小兵 何维 《细胞与分子免疫学杂志》 CAS CSCD 北大核心 2005年第4期449-451,455,共4页
目的:利用细胞内重组的方法,构建大库容量的人源性抗SARS病毒单链抗体(scFv)库,为筛选SARS病毒抗原的人源性抗体奠定基础。方法:取6例SARS康复患者的80mL外周血,分离淋巴细胞后提取总RNA。分离纯化mRNA并反转录成cDNA后,扩增抗体重链、... 目的:利用细胞内重组的方法,构建大库容量的人源性抗SARS病毒单链抗体(scFv)库,为筛选SARS病毒抗原的人源性抗体奠定基础。方法:取6例SARS康复患者的80mL外周血,分离淋巴细胞后提取总RNA。分离纯化mRNA并反转录成cDNA后,扩增抗体重链、轻链可变区基因片段。然后经重叠延伸PCR装配成scFv基因并克隆入噬粒载体pDAN5中,电转化大肠杆菌TG1构建初级抗体库。制备初级库噬菌体后,感染大肠杆菌BS1365进行细胞内重组制备次级抗体库。结果:初级库库容量为3×109,在大肠杆菌BS1365中重组后得到3×1011的次级抗体库。结论:细胞内重组方法的应用可使大库容量抗体库的构建变得简单易行。构建的抗SARS病毒单链抗体次库不仅接近人类天然抗体库的水平,而且多样性好,为筛选抗SARS病毒抗原的抗体提供了保证。 展开更多
关键词 冠状病毒 单链抗体库 细胞内重组
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表达HPCagA基因非复制型重组腺病毒的构建 被引量:1
2
作者 王璇 刘金保 +3 位作者 赵小东 吴淑华 董伟华 陆丽 《中国病理生理杂志》 CAS CSCD 北大核心 2005年第10期1981-1985,共5页
目的:构建表达幽门螺杆菌CagA基因的非复制型重组腺病毒,从而为探讨表达HeCagA的重组腺病 毒对哮喘TH1/TH2细胞因子的调控作用,获得防治哮喘的新方法奠定基础。方法:通过PCR扩增幽门螺杆菌CagA 基因,克隆至腺病毒穿梭载体pAdTrack-CMV... 目的:构建表达幽门螺杆菌CagA基因的非复制型重组腺病毒,从而为探讨表达HeCagA的重组腺病 毒对哮喘TH1/TH2细胞因子的调控作用,获得防治哮喘的新方法奠定基础。方法:通过PCR扩增幽门螺杆菌CagA 基因,克隆至腺病毒穿梭载体pAdTrack-CMV,该重组质粒与腺病毒DNA共转化E.coli BJ5183,通过细菌内同源重组 获得重组腺病毒DNA,将其转染293细胞获得重组腺病毒。结果和结论:成功构建了幽门螺杆菌CagA的非复制型重 组腺病毒。 展开更多
关键词 哮喘 螺杆菌 幽门 基因 CagA 腺病毒
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禽流感病毒H5N1血凝素基因和神经氨酸酶基因在真核酵母菌中的表达 被引量:2
3
作者 邹淑梅 于在江 +5 位作者 张烨 辛丽 陈永坤 陈禹保 陈清轩 舒跃龙 《实验动物科学》 2011年第3期1-5,共5页
目的克隆、表达和鉴定禽流感病毒H5N1血凝素基因(hemagglutinin,HA)和神经氨酸酶基因(neuramidinase,NA)序列,为制备抗体和基因工程疫苗打下基础。方法在成功克隆禽流感病毒H5N1全长HA、NA基因并测序的基础上,将部分基因序列克隆到表达... 目的克隆、表达和鉴定禽流感病毒H5N1血凝素基因(hemagglutinin,HA)和神经氨酸酶基因(neuramidinase,NA)序列,为制备抗体和基因工程疫苗打下基础。方法在成功克隆禽流感病毒H5N1全长HA、NA基因并测序的基础上,将部分基因序列克隆到表达载体pMET A上,构建了重组表达质粒pMET A/HA(49~1 587 bp)、pMET A/NA(121~1 200 bp),电转化真核酵母菌pMAD16,甲醇诱导表达,利用Ni2+亲和层析柱对重组蛋白进行纯化,并用Western Blotting和ELISA方法检测其抗原性。结果重组蛋白在酵母菌中可以高效表达,SDS-PAGE显示蛋白表达后形成了二聚体,蛋白纯度占总蛋白的95%以上,ELISA和Western Blotting实验证实,重组蛋白具有良好的抗原性。结论本研究成功克隆和表达了禽流感病毒H5N1 HA、NA基因序列,为禽流感病毒H5N1诊断试剂和疫苗的开发等进一步的研究提供了依据。 展开更多
关键词 禽流感病毒H5N1 血凝素 神经氨酸酶 真核酵母表达
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HIV感染早期病毒p24蛋白的检测 被引量:1
4
作者 王慧娟 皮国华 谷淑燕 《生物技术通讯》 CAS 2006年第1期68-69,共2页
目的:建立敏感、特异的检测血清中HIV-p24蛋白的方法,作为HIV感染早期即窗口期的监测手段。方法:用纯化的p24蛋白免疫小鼠及家兔,获得单克隆及多克隆抗体,经DEAE-52阴离子交换柱纯化后,标记辣根过氧化物酶,建立ELISA双抗体夹心及间接双... 目的:建立敏感、特异的检测血清中HIV-p24蛋白的方法,作为HIV感染早期即窗口期的监测手段。方法:用纯化的p24蛋白免疫小鼠及家兔,获得单克隆及多克隆抗体,经DEAE-52阴离子交换柱纯化后,标记辣根过氧化物酶,建立ELISA双抗体夹心及间接双抗体夹心方法,检测HIV-p24蛋白。结果:包被单抗、标记多抗或包被多抗、标记单抗,均能特异地检出系列稀释的p24蛋白,包被混合单抗较包被多抗更敏感;经标记的抗种属抗体放大可明显提高检测的敏感性。结论:建立了敏感、特异的检测p24蛋白的双抗体夹心法,间接放大方法可检出50pg/mL的HIV-p24蛋白,检测敏感性与国际同类产品相似。 展开更多
关键词 人类免疫缺陷病毒 早期诊断 双抗体夹心法 p24蛋白
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我国戊型肝炎研究 被引量:113
5
作者 庄辉 毕胜利 +4 位作者 王佑春 李凡 朱万孚 朱永红 李奎 《北京大学学报(医学版)》 CAS CSCD 北大核心 2002年第5期434-439,共6页
An epidemic of hepatitis in the south part of Xinjiang Uighur Autonomous Reg ion during 1986-1988, and 2 548 acute sporadic hepatitis cases from 17 cities of Ch i na were studied. The disease had following clinical an... An epidemic of hepatitis in the south part of Xinjiang Uighur Autonomous Reg ion during 1986-1988, and 2 548 acute sporadic hepatitis cases from 17 cities of Ch i na were studied. The disease had following clinical and epidemiological char acte ristics: 86.4% cases occurred in the age group of 20-59 years; with male prepon d erance and autumn-winter excess; 75% patients had a history of contact with hep a titis cases, and / or eating out or drinking unboiled water; clinical features w ere s imilar to hepatitis A, with a higher fatality rate, especially in pregnant women (up to 21%). Two strains of hepatitis E virus (HEV) isolated from Xinjiang were completely seq uenced by dideoxy chain termina tion method, with nucleotide homology of 93.5% and 94.5% with Burma strain (geno type 1), 75.7% and 75.9% with Mexico strain (genotype 2), 73.7% and 74.2 % with American strain (genotype 3), respectively. It suggests that these two st rains belong to genotype 1. The partial sequencing of open reading frame (ORF)2 region of 98 HEV isol ates from 19 cities of China revealed that 62 of them (63.3%) shared the same ge notype with Burma and Xinjiang strains, and 36 (36.7%) isolates were of genotype 4. One of the 36 strains was completely sequenced, with nucleotide identity of 75% with Burma strain, 74.5% with Mexico strain and 75.3% with American strain , respectively. Sera collected from 419 pigs, 190 cattle and 316 goats from var ious regions of China were detected for anti-HEV antibodies and HEV RNA using a n in-house enzyme immunoassay (EIA) and reverse transcriptase nested polymerase chain re action (RT-nPCR) with primers from ORF 2. The mean positivity rates of anti-HEV antibody for pigs and cattle were 78.8% and 6. 3%, respectively, but none of the goat sera was anti-HEV positive. The PCR product s (nt 6007- 6354) of 5 HEV RNA positive sera were sequenced and compared to othe r HEV sequences in the nucleotide databases. The five sequences shared 74%-79%, 73%-74%, 73%-78%, and 83%-99% identity to HEV genotypes 1,2,3 and 4, respe c tively. An enzyme immunoassay (EIA) and Western immunobloting (WB) for detection of anti-HEV and a reverse transcriptase nested polymerase chain reaction (RT- nPCR) of HEV RNA were developed. The anti-HEV EIA kit was approved by the State Drug Administration, China. An experimental model of HEV was established in rhe sus monkeys (Macaca mulatta). The animal studies on HEV cDNA vaccine and recombi nant vaccine showed that the humoral immune response to HEV was induced in mice after inoculation of the HEV RNA vaccine, and the HEV recombinant vaccine provid ed a protection from HEV infection in Rhesus monkeys. 展开更多
关键词 戊型肝炎 戊型肝炎病毒 分离 提纯 新疆维吾尔自治区 流行病学
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兰州地区难治性肺炎病毒病原检测及临床研究 被引量:8
6
作者 张蓉芳 谢志萍 +7 位作者 高寒春 刘东海 石永生 王永军 李桂荣 王卫凯 蒋成鹏 段招军 《中华实验和临床病毒学杂志》 CAS CSCD 2016年第5期465-468,共4页
目的探讨兰州地区难治性肺炎患儿中病毒病原的感染状况及临床特点.方法收集2013年1月至2013年12月甘肃省妇幼保健院难治性肺炎患儿肺泡灌洗液100例,应用PCR及RT-PCR方法检测9种常见呼吸道病毒:鼻病毒(HRV-A,B,C),呼吸道合胞病毒... 目的探讨兰州地区难治性肺炎患儿中病毒病原的感染状况及临床特点.方法收集2013年1月至2013年12月甘肃省妇幼保健院难治性肺炎患儿肺泡灌洗液100例,应用PCR及RT-PCR方法检测9种常见呼吸道病毒:鼻病毒(HRV-A,B,C),呼吸道合胞病毒(RSV),偏肺病毒(hMPV),流感病毒(IFVA,IFVB),副流感病毒1-3(HPIV1-3),冠状病毒(HCoV-HKU1、HCoV-NL63),肠道病毒(EV)及腺病毒(AdV),博卡病毒(HBoV)。结果53例标本病毒病原检测阳性,其中AdV阳性标本40例,检出率40%;其中AdV7型占大多数,共33例;其次为AdV2有6例,AdV1有1例;RSV 18例;检出率18%,IFVB5例,检出率5%;HRV4例,检出率4%;EV-68 1例;13例混合感染,混合感染率为24.53%(13/53)。腺病毒阳性和阴性患儿的临床特征比较显示:发热、呼吸衰竭、发绀和肺部实变4个临床表现在腺病毒阳性患儿中发生率高。结论病毒在兰州地区难治性肺炎中占有很重要的地位,其中腺病毒、尤其是AdV7型为当地流行的最主要的病毒病原,在临床治疗中应给与高度关注。 展开更多
关键词 难治性肺炎 PCR 病毒病原 儿童
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陕西省急性弛缓性麻痹病例中柯萨奇病毒A组4型的基因特征 被引量:15
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作者 王东艳 徐艺 +7 位作者 张勇 祝双利 司源 严冬梅 朱晖 杨倩 冀天娇 许文波 《病毒学报》 CAS CSCD 北大核心 2016年第2期145-149,共5页
阐明从陕西省2006~2010年急性弛缓性麻痹(Acute Flaccid Paralysis,AFP)病例中分离的柯萨奇病毒A组4型(Coxsackievirus A4,CV-A4)VP1编码区的基因特征,探索其在我国流行的优势基因型及其与AFP病例之间的关系。本研究通过逆转录-聚... 阐明从陕西省2006~2010年急性弛缓性麻痹(Acute Flaccid Paralysis,AFP)病例中分离的柯萨奇病毒A组4型(Coxsackievirus A4,CV-A4)VP1编码区的基因特征,探索其在我国流行的优势基因型及其与AFP病例之间的关系。本研究通过逆转录-聚合酶链反应(Reverse Transcription-Polymerase Chain Reaction,RT-PCR)对连续5年从AFP病例中分离的68株非脊灰肠道病毒(non-polio enteroviruses,NPEVs)进行分子定型,其中7株鉴定为CV-A4(7/68,10.3%);使用特异性引物扩增CV-A4VP1编码区并进行核苷酸序列测定分析和基因进化分析,将CV-A4划分为A(基因组1)、B(基因组2)和C三个基因型,其中C基因型又划分为C1(基因组3)和C2(基因组4)两个基因亚型。中国分离的CV-A4均位于第4基因组,属于C2基因亚型,提示其可能为中国大陆CV-A4的优势基因亚型;7株陕西CV-A4毒株依据分离年代的不同位于不同的三个小进化分支里,且和来自山东和吉林两省的邻近年份的CV-A4毒株位于同一小分支,提示7株陕西CV-A4分离株和它们存在共同进化和共循环。在无脊髓灰质炎时代应进一步加强监测CV-A4在AFP病例NPEV所占的比例和动态变化。 展开更多
关键词 急性弛缓性麻痹病例 柯萨奇病毒A组4型 亲缘关系进化树 优势基因型
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抗甲肝病毒人源基因工程全抗体分子在杆状病毒中的表达 被引量:2
8
作者 曹经瑗 梁米芳 +6 位作者 孟庆玲 王晓芳 许永刚 郭可謇 詹美云 毕胜利 李德新 《中华实验和临床病毒学杂志》 CAS CSCD 北大核心 2004年第1期20-23,共4页
目的 探讨人源抗甲型肝炎病毒全抗体分子在杆状病毒中的表达。方法 将获得的人源抗甲肝病毒中和性抗体Fab段基因克隆入含信号肽及Fc的杆状病毒表达载体中并在杆状病毒细胞中表达。结果 获得了中和性人源抗甲肝病毒全抗体分子的表达... 目的 探讨人源抗甲型肝炎病毒全抗体分子在杆状病毒中的表达。方法 将获得的人源抗甲肝病毒中和性抗体Fab段基因克隆入含信号肽及Fc的杆状病毒表达载体中并在杆状病毒细胞中表达。结果 获得了中和性人源抗甲肝病毒全抗体分子的表达产物并进行了纯化 ,轻重链表达产物位置大小正确 ,HAFc16抗体能与具有中和活性的鼠抗甲肝病毒单克隆抗体产生竞争抑制反应 ,并能在体外中和甲肝病毒 ,另一株HAFc78抗体同样具有体外中和甲肝病毒的活性 ,但系抗不同位点的抗体。结论 获得的人源抗甲肝病毒全抗体分子表达产物具有很好的体外中和甲肝病毒的活性 ,且为抗不同位点的抗体 ,为这些抗体的进一步开发及应用打下了基础 ,为防止甲型肝炎暴发流行提供应急措施。 展开更多
关键词 甲肝病毒 基因工程 杆状病毒 肝炎抗体 全抗体分子
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2017年兰州市5岁以下儿童病毒性腹泻分子流行病学分析 被引量:9
9
作者 王芳 靳淼 +2 位作者 李丹地 章青 李宇宁 《中国生物制品学杂志》 CAS CSCD 2019年第10期1102-1107,共6页
目的分析2017年兰州市5岁以下儿童病毒性腹泻病原体及其流行特点,为病毒性腹泻的防控提供科学依据。方法收集2017年就诊于兰州大学第一医院儿科的5岁以下急性腹泻患儿粪便样本219份,采用双抗体夹心ELISA法检测A组轮状病毒(rotavirus A,R... 目的分析2017年兰州市5岁以下儿童病毒性腹泻病原体及其流行特点,为病毒性腹泻的防控提供科学依据。方法收集2017年就诊于兰州大学第一医院儿科的5岁以下急性腹泻患儿粪便样本219份,采用双抗体夹心ELISA法检测A组轮状病毒(rotavirus A,RVA),阳性样本采用RT-PCR法进行G/P分型;同时采用RT-PCR法鉴定人杯状病毒(human calicivirus,HuCV)、人星状病毒(human astrovirus,HAstV),PCR法鉴定腺病毒(adenovirus,AdV),阳性样本进行测序。结果219份样本中,病毒总检出率80.37%,其中居于首位的是RVA(51.60%),其次为HuCV(20.09%)、AdV(4.11%)及HAstV(4.57%)。RVAG基因型中以G9(90.27%)为主,P基因型以P[8](91.15%)为主,其次为P[4](7.96%),二者组合主要为G9P[8](88.50%)。HuCV全部为诺如病毒(noruvirus,NoV),未检出札如病毒,NoV以GⅡ-4型(52.27%)为主,其次为GⅡ-3型(36.36%),仅1例GⅠ-3型。AdV以F组的41型(55.56%)为主,HAstV全部为1型。病毒性腹泻的高发季节特点以RVA最为明显,在第4季度,高危人群年龄在0~17月龄。结论兰州市5岁以下儿童病毒性腹泻病原多样,RVA为最主要病原,主要流行株为G9P[8],其次为NoV,主要流行株为GⅡ-4型,与近年全国流行的优势基因型相同。 展开更多
关键词 病毒性腹泻 儿童 流行病学 基因型
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禽流感病毒H5N1血凝素基因和神经氨酸酶基因在大肠杆菌中的表达
10
作者 邹淑梅 于在江 +6 位作者 张烨 辛丽 陈永坤 唐启慧 陈禹保 陈清轩 舒跃龙 《中国生物工程杂志》 CAS CSCD 北大核心 2010年第1期12-18,共7页
目的:克隆、表达和鉴定禽流感病毒H5N1血凝素基因(hemagglutinin,HA)和神经氨酸酶基因(neuram idinase,NA)序列,为制备抗体和基因工程疫苗打下基础。方法:在成功克隆禽流感病毒H5N1全长HA、NA基因并测序的基础上,将部分基因序列克隆到... 目的:克隆、表达和鉴定禽流感病毒H5N1血凝素基因(hemagglutinin,HA)和神经氨酸酶基因(neuram idinase,NA)序列,为制备抗体和基因工程疫苗打下基础。方法:在成功克隆禽流感病毒H5N1全长HA、NA基因并测序的基础上,将部分基因序列克隆到表达载体pET32a(+)上,全基因序列克隆到表达载体pGEX4T-1上,构建了重组表达质粒pET32a(+)/HA(49~1587bp)、pET32a(+)/NA(121~1141bp)、pGEX4T-1/HA、pGEX4T-1/NA,转化大肠杆菌BL21/rosetta,IPTG诱导表达,利用Ni2+亲和层析柱和GSTraP4B亲和层析柱对重组蛋白进行纯化,并用Western blotting和ELISA方法检测其抗原性。结果:重组蛋白在大肠杆菌中可以高效达,SDS-PAGE显示其相对分子质量与预计大小一致,蛋白纯度占总蛋白的90%以上。ELISA和Western blotting实验证实,重组蛋白具有良好的抗原性。结论:成功克隆和表达了禽流感病毒H5N1HA、NA基因序列,为禽流感病毒H5N1诊断试剂和疫苗的开发等进一步的研究奠定了基础。 展开更多
关键词 禽流感病毒H5N1 血凝素 神经氨酸酶 克隆表达
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干扰素对M2e-HBc疫苗鼻内免疫的佐剂作用
11
作者 吕宏亮 刘松友 +4 位作者 董小曼 沈心亮 毕胜利 冯玉萍 马忠仁 《医学研究杂志》 2008年第11期97-99,共3页
目的研究干扰素对鼻腔黏膜免疫M2e-HBc疫苗的佐剂作用。方法小鼠经鼻腔黏膜免疫,用流感病毒攻击。测定抗体水平和对小鼠的保护。结果小鼠可产生局部和系统保护性抗体IgA、IgG,对流感病毒的亚致死性攻击产生完全保护。结论干扰素对M2e-HB... 目的研究干扰素对鼻腔黏膜免疫M2e-HBc疫苗的佐剂作用。方法小鼠经鼻腔黏膜免疫,用流感病毒攻击。测定抗体水平和对小鼠的保护。结果小鼠可产生局部和系统保护性抗体IgA、IgG,对流感病毒的亚致死性攻击产生完全保护。结论干扰素对M2e-HBc疫苗鼻内免疫具有较强的免疫佐剂作用。 展开更多
关键词 M2e-HBc疫苗 鼻内免疫 干扰素 佐剂作用
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中国脊髓灰质炎实验室网络2007~2015年细胞敏感性监测与评价 被引量:17
12
作者 王东艳 张勇 +5 位作者 安洪秋 严冬梅 朱晖 李晓嫘 许文波 祝双利 《中国疫苗和免疫》 北大核心 2016年第2期138-142,124,共6页
目的通过对中国(未包括香港、澳门特别行政区和台湾地区)脊髓灰质炎(脊灰)实验室网络(Chinese Poliomyelitis Laboratory Network,CPLN)2007年4月~2015年4月连续的细胞敏感性(Cell Sensitivity,CS)监测结果进行分析,评估其在脊... 目的通过对中国(未包括香港、澳门特别行政区和台湾地区)脊髓灰质炎(脊灰)实验室网络(Chinese Poliomyelitis Laboratory Network,CPLN)2007年4月~2015年4月连续的细胞敏感性(Cell Sensitivity,CS)监测结果进行分析,评估其在脊灰实验室检测质量控制中的重要作用。方法全国脊灰实验室网络中所有实验室统一使用96孔微量板病毒滴定法在L20B细胞和RD细胞上对三个型别的脊灰病毒的敏感性进行检测。结果从2007~2015年,在CPLN中,有30个省级脊灰实验室已开展CS监测并按时向国家脊灰实验室上报结果,目前西藏由于实验室条件所限尚未开展CS监测。八年间的CS监测结果显示30个省级脊灰实验室的实验室质量控制(LQC)株滴度均在正常范围±0.5 logCCID_(50)/0.1ml波动。结论 2007~2015年CPLN中各个实验室所用的L20B和RD细胞对脊灰病毒敏感性处于正常范围内,细胞系状态稳定,对三个型别的脊灰病毒均敏感。CS监测作为CPLN质量控制的重要指标保证了实验室检测脊灰病毒的敏感性,为从细胞中扩增出低滴度的脊灰病毒提供了保障,对输入脊灰野病毒或疫苗衍生脊灰病毒(VDPV)的早期发现至关重要。 展开更多
关键词 脊髓灰质炎实验室网络 细胞敏感性监测 实验室质量控制株
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中国脊髓灰质炎实验室网络开展细胞系支原体检测及现状分析 被引量:13
13
作者 王东艳 祝双利 +6 位作者 张勇 严冬梅 朱晖 李晓嫘 宋洋 黄克强 许文波 《中国疫苗和免疫》 北大核心 2017年第1期8-12,共5页
目的通过对中国脊髓灰质炎(脊灰)实验室网络(China Polio Laboratory Network,CPLN)开展细胞系支原体检测(Cell mycoplasma detection,CMD),评价CMD在细胞质量控制中的作用,探讨其与脊灰病毒分离率的联系。方法采用巢式聚合酶链反应(Nes... 目的通过对中国脊髓灰质炎(脊灰)实验室网络(China Polio Laboratory Network,CPLN)开展细胞系支原体检测(Cell mycoplasma detection,CMD),评价CMD在细胞质量控制中的作用,探讨其与脊灰病毒分离率的联系。方法采用巢式聚合酶链反应(Nested polymerase chain reaction,n PCR)法对CPLN常规使用的RD、L20B细胞系进行支原体检测。结果 2013年8月至2016年8月,在CPLN中除西藏外的30个省级脊灰实验室已正式开展CMD,并按时向国家脊灰实验室上报结果。CMD结果显示,30个省级脊灰实验室所用的每个批次的L20 B和RD细胞,支原体检测结果均为阴性。结论三年间CPLN 30个省级脊灰实验室用于脊灰病毒分离的细胞系均未出现支原体污染,细胞系质量正常且稳定;CMD作为CPLN细胞质量控制的重要组成部分,为CPLN运转质量提供可靠的数据支撑。 展开更多
关键词 脊髓灰质炎实验室网络 细胞系支原体检测 细胞质量控制
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