应用荧光定量PCR检测环境样品中鼠疫耶尔森菌

目的应用荧光定量聚合酶链反应(PCR)法检测土壤和动物脏器中鼠疫耶尔森菌,评价并优选环境样品目标核酸的纯化方法。方法应用TaqMan荧光定量PCR技术,以鼠疫耶尔森菌pla、caf1、hms引物、探针为指标,比较不同种从土壤和脏器中纯化鼠疫耶尔森菌核酸的方法。结果应用NaIGlassmilk方法及荧光定量PCR检测土壤中的鼠疫菌,检出底限为104拷贝/g土壤(pla),从染疫动物脾脏、肝脏标本中也能敏感检出鼠疫菌。结论荧光定量PCR方法和NaI裂解Glassmilk制备模板联合应用可灵敏特异地从土壤和动物脏器中检测鼠疫耶尔森菌。

应用Taq Man荧光PCR定性定量检测炭疽芽孢杆菌

目的 发展一种快速、敏感、特异的检测炭疽芽孢杆菌的方法。方法 应用基于TaqMan荧光探针的实时(real time)PCR技术,针对致病炭疽毒株的两个质粒pXO1、pXO2上的pagA ,cap基因和染色体上的ropB基因设计引物和探针定性、定量检测炭疽芽孢杆菌。构造并应用上述探针的外标对照及pagA的内标对照,采用多重荧光定量PCR技术建立荧光定量方法并发现假阴性;采用UDG抗污染和ROX矫正背景噪音,提高检验能力;用该方法检测炭疽芽孢杆菌疫苗株感染的动物脾脏标本,盲法评价该方法在实际工作的应用。结论 该方法能特异、灵敏、高效地检测炭疽芽孢杆菌,该方法的推广和应用对有效防范炭疽生物恐怖袭击、提高突发事件应对能力、快速诊断具有重要意义。

应用荧光PCR检测土壤、脏器中的炭疽芽孢杆菌

目的用荧光定量PCR方法检测土壤、动物脏器和血液中炭疽芽孢杆菌,评价并优选目标核酸纯化方法。方法采用TaqMan荧光定量PCR技术,以炭疽芽孢杆菌pagA、rpoB2引物探针和相应外标、内标为手段,比较4种从土壤中检测炭疽菌及3种从感染脏器及血液中检测炭疽菌的方法,探讨环境和组织样品中抑制因素对荧光定量PCR检测的影响,优选并确定纯化检验手段。结果应用NaI裂解glassmilk纯化炭疽菌核酸并用荧光定量PCR检验,检出底限为2·5万拷贝/g土壤(pagA),从血液样本的检出限为1000拷贝/ml。结论荧光定量PCR技术和NaI裂解glassmilk纯化制备模板的联合应用可灵敏、特异地从土壤、血液中检测炭疽芽孢杆菌。

聚合酶链反应方法检测鼠疫耶尔森菌的内部对照研究

目的 避免聚合酶链反应 (PCR)方法检测鼠疫菌发生假阴性。方法 通过克隆 ,将16SrRNA引物的扩增产物与鼠疫菌F1抗原基因克隆子相连 ,并以其作为内部对照模板进行PCR试验。结果 得到了在包含F1抗原基因中连接有 16SrRNA扩增产物的质粒 ,并初步确立了作为内部对照质粒的参照标准浓度。结论 在采用PCR方法检测鼠疫菌时 ,加入适宜浓度的内部对照质粒作为模板与待检样品同时扩增 ,可避免假阴性的发生。