三氯化铁-聚偏氟乙烯膜滤器富集噬菌体方法的建立和评价

目的建立和评价基于三氯化铁-聚偏氟乙烯(FeCl_(3)-PVDF)膜滤器富集自然水体中噬菌体的方法。方法基于絮凝浓缩原理,利用铁离子絮凝结合膜过滤器建立从水样中回收噬菌体的方法。利用琼脂双层法测定噬菌体滴度、噬菌体荧光染色观察和实时荧光PCR反应等方法检测噬菌体的回收效率。采集不同来源的水体标本进行模拟实验评价富集效果,同时以医院排出污水作为实际水样,利用临床常见的耐药菌作为宿主指示菌,进一步分析FeCl_(3)-PVDF膜滤器富集方法对自然实际水样中噬菌体的富集效果。结果建立了铁离子浓度50 mg/L,采用PVDF膜滤器富集自然水体中噬菌体的方法。该方法对噬菌体的回收率为93%~100%;在多功能显微镜下观察发现富集后水样的噬菌体明显增多,酶标仪测定富集后水样荧光值约为富集前的13倍;对医院外排水实际水样浓缩处理后,浓缩组和未浓缩组噬菌体的分离阳性率分别为23%和4%,浓缩组荧光值为未浓缩组的2~24倍。结论FeCl_(3)-PVDF膜滤器方法可简便、高效快速地富集不同水体样本中噬菌体。

含扩增内对照的霍乱毒素基因ctx和不耐热肠毒素基因elt三重real-time PCR检测体系的建立

目的：建立一个含扩增内对照（IAC）的三重TaqMan real-time PCR体系，以检测霍乱毒素基因ctxA和肠产毒性大肠埃希菌的不耐热肠毒素基因elt。方法针对ctxA、elt和IAC设计引物和探针，进行灵敏性和特异性分析，评价三重反应之间的互相影响。结果该检测体系灵敏度为ctxA每个反应94拷贝，elt每个反应79拷贝，扩增效率分别为94.7%与98.1%。ctxA与elt拷贝数比例为1∶1～1∶10时，二者均能良好扩增；elt或ctxA的量是IAC的100倍以上时，IAC扩增受到抑制。结论该检测体系具有良好的灵敏性和特异性，可以用于腹泻粪便中感染病原菌的检测，其中内对照检测可以提示粪便样本中是否存在PCR抑制因子。

O1和O139群霍乱弧菌超级整合子VchintIA基因的变异

目的研究不同血清群(型)霍乱弧菌超级整合子整合酶基因(VchintIA)的变异及其与霍乱弧菌分类的关系。方法使用聚合酶链反应(PCR)和序列测定的方法对VchintIA基因进行扩增和序列分析。结果在实验菌株中,O1El Tor和O139群霍乱弧菌产毒株以及毒素共调菌毛(toxin co-regulated pilus,tcp)基因簇阳性的O1群非产毒株的VchintIA序列完全一致,tcp基因簇阴性的O1群非产毒株的VchintIA序列在核苷酸水平上与产毒株不同,但是在氨基酸水平上相同。O139非产毒株的VchintIA序列在核苷酸和氨基酸水平上均与产毒株的VchintIA不同。结论 O1和O139霍乱弧菌超级整合子VchintIA存在核苷酸和氨基酸水平上的变异,O139非产毒株中VchintIA的变异与其整合子内部的结构可能相关。