马传染性贫血病毒膜蛋白基因的改造及其在真核细胞中的表达

以马传染性贫血病毒(equine infectious anemia virus,EIAV)天然膜蛋白基因(gp120)为基础设计的DNA疫苗在马体内的表达量很低,这与密码子使用偏嗜性、RNA剪切位点多和导致RNA不稳定性的腺苷丰富区的大量存在有关。为解决这些问题,合成了EIAVgp120基因(Syn-env),使其密码子偏嗜性符合高水平表达的哺乳动物基因。EIAV弱毒疫苗的制备过程中,出现了几个重要而稳定的N-糖基突变位点,以Syn-env为基础,运用重叠延伸PCR定点突变策略获得了6个具有不同N-糖基缺失组合的gp120基因。将突变后的基因克隆到真核表达载体pVRCSV1.0,然后转染Hela细胞,发现这些重组质粒均获得了表达。进而为比较6种质粒诱导机体免疫保护效果,阐明EIAV弱毒疫苗减毒机理奠定了基础。

HIV实验室检测研究进展和发展趋势

随着分子生物学技术的飞速发展 ,人类免疫缺陷病毒 (HIV)的实验室检测技术也在不断更新。本文着重阐述了 HIV血清学第四代检测试剂盒的特点 ,应用抗体亲和力技术估计发病率 ,荧光实时定量 PCR技术的应用以及基因芯片技术的发展趋势。

增强子驱动的Cre转基因小鼠的构建及Cre基因的表达鉴定

目的:探索将增强子应用于构建Cre转基因小鼠品系,为以条件基因敲除为基础的基因功能研究提供更多的工具。方法:通过PCR方法从小鼠的细菌人工染色体扩增UH增强子片段,构建含有Hsp68基础启动子、增强子UH、Cre重组酶基因和SV40 polyA的转基因载体pLW400,将3.3 kb的转基因片段通过显微注射导入小鼠受精卵;为了检测Cre在转基因小鼠中的表达,将转基因一代小鼠与纯合子ROSA26报告小鼠(R/R)交配,收集第14 d胚胎期(E14)的舌组织进行LacZ染色检测鉴定。结果:经鉴定,31只子代小鼠中有6只携带外源基因,整合率为19.4%;与R/+对照相比,E14期的双基因型Cre,R/+舌组织为阳性结果(蓝色)。这表明Cre基因在转基因小鼠舌组织内得到表达,并在体内介导ROSA26基因座loxP位点间的重组,且有效删除了2个loxP之间的片段,从而启动了LacZ基因的表达。结论:构建了UH增强子-Hsp68Cre的转基因小鼠,在舌肌中特异表达Cre基因,提示增强子可以被选择应用于Cre转基因小鼠的构建;为舌肌的发育和再生研究奠定了基础。

利用细菌人工染色体同源重组对小鼠基因进行条件型敲除

目的:探索通过细菌人工染色体(BAC)同源重组系统构建条件基因敲除载体的高效率方法,提高条件基因敲除小鼠(Flox小鼠)的构建效率。方法:利用作者自己构建的噬菌体重组酶系统,通过BAC同源重组进行条件型基因敲除载体构建工作。首先通过亚克隆构建了一系列载体含有同源臂的靶向质粒,线性化后,打靶片段经电穿孔法转入大肠杆菌内,与相应的BAC同源重组,再经过三步同源重组和一步位点特异性重组,构建小鼠条件型基因敲除载体。结果:高效率构建了小鼠基因的最终条件基因敲除载体。结论:通过BAC同源重组高效构建条件基因敲除载体,为条件基因敲除载体的构建提供了全新思路,并为FLox小鼠的建立,及相应基因在发育、生理、致病机制等方面的功能研究奠定了基础。

中国CRF01-AE亚型人类免疫缺陷病毒毒株的分子流行病学研究

目的 通过对两次全国范围人类免疫缺陷病毒 (HIV)毒株分子流行病学研究 (NationalMolecularEpidemicStudy ,NMES)中发现的CRF0 1_AE重组HIV 1毒株的分析 ,研究该重组型毒株在我国的流行特点和基因变异特征。方法 从HIV感染者血液中提取前病毒DNA ,使用套式聚合酶链反应 (nested PCR)扩增HIV 1的env基因C2～V4区 ,PCR产物直接测序并使用GCG软件包进行序列分析。结果 到 2 0 0 2年底 ,从全国 31个省市自治区采集的标本中发现CRF0 1_AE重组型样本 16 9份 ,分布在 17个省。虽然CRF0 1_AE重组型仍然以性传播人群为主 [NMES1为 6 2 2 % (2 3/ 37) ,NMES2为5 5 3% (73/ 132 ) ],但吸毒人群中感染该重组型的比例明显增加 ,由NMES1的 2 7% (10 / 37)增加到NMES2的 4 1 6 % (5 7/ 137)。系统树分析可明显看到NMES2吸毒人群流行毒株远离NMES2中性传播人群和NMES1吸毒人群流行毒株。NMES2吸毒人群流行毒株的V3区氨基酸较保守 ,但C3区第 6、8、9、10、12、15、16位氨基酸呈现出规律性变化。结论 CRF0 1_AE亚型已从东南沿海和西南边境扩散至内陆 ,吸毒人群中该亚型比例不断上升。NMES2吸毒人群和NMES1吸毒人群中流行的CRF0 1_AE重组毒株序列明显不同 ,显示其可能有新的来源 ,并呈现扩大流行的态势。