1996～1998年中国流行的E亚型艾滋病病毒1型毒株的分子流行病学研究

目的通过对1996～1998年采集的艾滋病病毒1型(HIV-1)毒株样本的env基因的序列分析,阐明在中国流行的E亚型HIV-1毒株的特点、来源和传播方式。为中国E亚型HIV-1疫苗的研制和应用提供基础资料。方法 从HIV感染者淋巴细胞(PBMC)中提取前病毒DNA.使用嵌套式聚合酶链反应(PCR)方法扩增HIV-1的env基因的C2V5区。PCR产物不经克隆直接测序并使用GCG软件包进行序列分析。结果样品采自1996～1998年中国29个省(自治区,直辖市),总共发现37个E亚型HIV-1感染者。他们中大部分是通过性途径感染(23人,占62.2％);部分在静脉吸毒人群中发现(10人,占27.0％);少数是在职业献血员中发现(4人,占10.8％)。经C2-V3区序列分析发现,大部分中国E亚型HIV-1毒株与泰国株很相近,而与非洲株相差很大。而来自广西壮族自治区的毒株与越南吸毒人群中的流行株U48720相一致;系统树分析结果发现,中国的E亚型HIV-1株与泰国(CM240X、H93TH966)、越南(U48720)的代表株聚在一起。结论 中国E亚型HIV-1毒株目前仅在东南沿海地区流行,涉及静脉吸毒、输供血和性乱等各种人群,通过env区的序列分析发现其主要来源于泰国,部分来源于与中国接壤的越南。

中国部分地区艾滋病病毒1型母婴传播回顾性追踪调查

目的 了解中国艾滋病病毒1型(HIV-1)母婴传播的现状,特别是母婴传播的发生率和影响因素,为进一步开展预防阻断工作提供背景资料。方法 以地方卫生防疫和医疗机构的哨点监测、产前筛查、日常检测和门诊中发现的HIV-1阳性孕产妇为对象,对其所生子女进行追踪调查和检测。结果 对来自云南、河南、新疆等10个省(自治区、直辖市)的87例HIV-1阳性母亲所生的94名儿童进行追踪,最后追踪到75例母亲及其所生的80名儿童,HIV-1母婴传播发生率为35.0％(28/80)。而河南省的母婴传播率为41.7％(10/24),云南省和新疆维吾尔自治区分别为33.3％(11/33)和27.3％(3/11)。对相关影响因素的分析发现,母亲的感染途径、生产胎次和喂养方式对HIV-1母婴传播有一定的影响作用,其中输血传播、初产和母乳喂养是高危因素。相应的母婴传播率分别为45.5％、39.2％和36.2％,而性传播、多胎生产及人工喂养分别为32.1％、25.9％和22.2％,但差异无显著统计学意义。结论 该研究表明,中国HIV-1母婴传播率与亚非发展中国家相似,而高于西方发达国家。对相关的高危因素(如孕妇的感染途径,特别是输血传播)有必要作进一步地研究。

暗娼艾滋病行为监测分析

目的了解暗娼艾滋病相关知识和危险行为水平。方法采用二阶段比例概率抽样方法,选择全国5个项目地区不同娱乐场所暗娼进行问卷调查。结果联合国人类免疫缺陷病毒(HIV)/艾滋病(AIDS)特别大会(UN-GASS)关于艾滋病指标相关知识知晓率为35.9%,各地区知晓率差异有统计学意义(χ2=294.7,P<0.001)。最近一次商业性行为时,安全套使用率为84.3%,不使用的主要原因是嫖客不愿使用为32.4%;不同文化程度之间安全套使用的频率差异有统计学意义(χ2=56.42,P<0.001)。5个项目地区暗娼人群吸毒率为0.9%。31.0%的调查对象在过去一年内出现过性病相关症状和体征,30.0%选择到私人诊所就诊。78.9%的调查对象接受过有关艾滋病预防服务。结论暗娼人群艾滋病相关知识知晓率低,安全套使用率低,暗娼中存在吸毒人群,艾滋病性传播控制难度较大,需要加强针对性干预措施。

重庆市艾滋病分子流行病学调查

目的 对重庆市艾滋病病毒感染者/艾滋病病人(HIV/AIDS)进行分子流行病学调查,为重庆市乃至全国的艾滋病预防控制工作提供有价值的资料。方法 传统流行病学与分子流行病学方法相结合,对重庆市HIV/AIDS的疫情特征进行分析,对重庆市HIV毒株作基因序列分析,总结其传播途径与亚型之间的关系,分析不同亚型在重庆市流行的时间及变异程度,并提出预防控制工作重点。结果 目前重庆市HIV感染率达11.7/10万,女性感染者比例高于全国平均水平;重庆市流行毒株有B’、C、E、G4种亚型,C亚型占优势,G亚型为全国首次发现。结论 重庆市艾滋病流行形势严峻,迫切需要深入开展研究,并在高危人群中开展行为干预措施。

采用流式细胞仪检测艾滋病病毒1型膜蛋白小鼠免疫后IFN-γ的表达

目的通过流式细胞技术检测艾滋病病毒1型(HIV-1)Gp120膜蛋白免疫小鼠后的IFN-γ的表达。方法 构建表达HIV-1gp120基因的复制型重组痘苗病毒。与DNA疫苗联合免疫小鼠,用流式细胞仪检测小鼠脾淋巴细胞中IFN-γ的表达。结果 获得表达中国HIV-1流行株gp120基因的重组痘苗病毒rVVgp120、rVVM304,能正确表达Gp120蛋白。与DNA疫苗p120-VRC、pM304-VRC联合免疫小鼠后,用流式细胞仪检测到小鼠脾淋巴细胞能特异性的表达IFN-γ。结论 用流式细胞检测技术成功检测到免疫小鼠的脾淋巴细胞特异性的表达IFN-γ,用此方法可方便快捷地检测小鼠的细胞免疫效果。

人免疫缺陷病毒Ⅰ型基因序列分析中的质量控制研究

目的 研究DNA序列分析中各种影响因素的作用,建立排除污染、进行序列质量控制的方法。方法 通过对 950份HIV 1样品DNA基因序列结果的分析,查找序列读取及序列分析中存在的各种影响因素,对各种可能导致污染的原因进行分析和解释。结果 在使用各种软件进行序列分析时,两样本之间的基因距离为 0;两样本所测区段的核苷酸或氨基酸序列完全一致或相差甚微;样本与实验室内所构建的克隆株之间的基因距离过近,同源性达到 99%以上;两个独立传播的群体之间个别样本的互混等指标均提示存在污染的可能。结论 构建基因进化树和将样本的核苷酸序列翻译成蛋白质的氨基酸序列后构建共享序列,是一种很好的发现序列质量问题、进行序列质量控制的方法。

广西HIV-1毒株膜蛋白V3环氨基酸变异分析

目的了解广西HIV-1亚型膜蛋白V3环的氨基酸序列特征及变异特点。方法应用nest-PCR对46份来自广西主要流行区的HIV-1重组毒株env基因区进行扩增后,使用ABI310型测序仪测序,然后应用CLUSTAL、MEGA和dnatools等生物学软件对env基因区V3环及其临近区域的氨基酸序列进行分析。结果46份基因序列,43份为CRF01-AE(93.48%),3份为CRF08-BC(6.52%);V3环氨基酸序列分析显示,CRF01-AE毒株存在7种类型:GPGQ(74.4%)、GPGR(9.3%)、GPGK(4.7%)、GPGH(4.7%)、GPGA(2.3%)、GRGE(2.3%)和RPGE(2.3%),而CRF08-BC毒株V3顶端四肽为GPGQ;根据V3环关键氨基酸推测辅助受体使用情况,结果显示:60.47%的CRF01-AE重组毒株可能使用CCR5为辅助受体,39.53%不能对辅助受体的使用做出预测,CRF08-BC重组毒株100%可能使用CCR5。结论目前广西HIV-1的主要流行株是CRF01-AE;V3环序列高度变异,顶端四肽主要是GPGQ,可能为NSI型毒株。

重组杆状病毒表达的EIAVEnv蛋白与含有env基因重组痘苗病毒的联合免疫

目的 :构建新型的马传染性贫血病毒 (EIAV)的候选疫苗。方法 :利用BAC To BAC杆状病毒表达系统 ,将中国马传贫驴白细胞弱毒疫苗 (EIAVDLV)及其亲本株 (EIAVLN)env基因导入到杆状病毒基因组中。转染昆虫细胞后 ,得到的重组病毒用SDS PAGE和Westernblot检测表达产物。以本实验室构建的含有EIAVenv基因的重组痘苗病毒 ,单独或与重组杆状病毒表达的EIAVEnv蛋白联合免疫小鼠。结果 :构建的重组杆状病毒能正确表达全长Env蛋白。与单独免疫组相比 ,联合免疫组免疫应答显著增强 ,其中中和抗体的滴度提高5～ 9倍。结论 :含有EIAVenv基因的重组痘苗病毒与Env蛋白抗原联合免疫 ,能够诱导高滴度的中和抗体。

广西HIV-1重组流行株env基因V3-V4区序列变异分析

[目的]分析广西HIV-1重组流行株env基因V3-V4区及其临近区域的基因变异。[方法]应用nest-PCR对24份来自广西主要流行区的HIV-1重组毒株env基因区进行扩增后,使用ABI310型测序仪测序,然后应用CLUSTAL、MEGA和dnatools等生物学软件对env基因区V3-V4区及其临近区域进行序列分析。[结果]24份毒株中21份为CRF01-AE(93.48%),3份为CRF08-BC(6.52%);系统树分析显示,21份与分离于广西地区的CRF01-AE.97CNGX2f和泰国代表毒株THCM240接近,3份CRF08-BC重组毒株中有2份与CRF08-BC.98CN006和CRF08-BC.97CNGX6f靠近,还有1份样本则接近C.95IN21068;env基因V3-V4区核苷酸序列分析显示,广西的样本与分离于该地区的代表毒株基因距离较小,CRF01-AE和CRF08-BC重组毒株的氨基酸替换主要发生在C3和V4区,而V3区氨基酸序列相对保守。[结论]CRF01-AE重组毒株env基因V3-V4区的变异主要发生在C3和V4区,而不是V3区。

马传染性贫血病毒膜蛋白基因的改造及其在真核细胞中的表达

以马传染性贫血病毒(equine infectious anemia virus,EIAV)天然膜蛋白基因(gp120)为基础设计的DNA疫苗在马体内的表达量很低,这与密码子使用偏嗜性、RNA剪切位点多和导致RNA不稳定性的腺苷丰富区的大量存在有关。为解决这些问题,合成了EIAVgp120基因(Syn-env),使其密码子偏嗜性符合高水平表达的哺乳动物基因。EIAV弱毒疫苗的制备过程中,出现了几个重要而稳定的N-糖基突变位点,以Syn-env为基础,运用重叠延伸PCR定点突变策略获得了6个具有不同N-糖基缺失组合的gp120基因。将突变后的基因克隆到真核表达载体pVRCSV1.0,然后转染Hela细胞,发现这些重组质粒均获得了表达。进而为比较6种质粒诱导机体免疫保护效果,阐明EIAV弱毒疫苗减毒机理奠定了基础。

HIV实验室检测研究进展和发展趋势

随着分子生物学技术的飞速发展 ,人类免疫缺陷病毒 (HIV)的实验室检测技术也在不断更新。本文着重阐述了 HIV血清学第四代检测试剂盒的特点 ,应用抗体亲和力技术估计发病率 ,荧光实时定量 PCR技术的应用以及基因芯片技术的发展趋势。

马传染性贫血病毒gp90蛋白的表达及其在诊断中的潜在应用

以质粒pVRCSV1.0-syn-gp90为模板,利用PCR扩增马传染性贫血病毒外膜蛋白基因(gp90),构建了原核表达质粒pET-28a(+)-gp90,然后转化大肠杆菌Rosetta(DE3),诱导表达并纯化该重组蛋白,ELISA和Western blot证明马的阳性血清可以识别该重组蛋白。以纯化的融合蛋白免疫新西兰大白兔制备多克隆抗体,测定的效价为1∶13,000。

EIAV env基因在痘苗病毒中的表达及其免疫效果的观察

将马传贫驴白细胞弱毒疫苗及其亲本株env基因克隆到痘苗病毒表达载体pSC65的pE/L启动子下游,通过同源重组插入到痘苗病毒天坛株基因组TK区,经蓝白斑筛选获得重组痘苗病毒rvv-DLVenv和rvv-LNenv,Western blot检测目的蛋白的表达,结果表明重组痘苗病毒能够有效表达完整的EIAV Env蛋白,其肌肉接种免疫小鼠后,表达的目的蛋白具有良好的免疫原性,能够诱导机体产生有效的体液和细胞免疫应答,其中以细胞免疫效果更为显著,CTL特异性裂解最高可达28％。本研究为EIAV基因工程疫苗的开发研制奠定了基础。

重组杆状病毒表达的EIAV Env蛋白与含有env基因重组痘苗病毒的联合免疫

目的:构建新型的马传染性贫血病毒(EIAV)的候选疫苗。方法:利用BAC-To-BAC杆状病毒表达系统,将中国马传贫驴白细胞弱毒疲苗(EIAV DLV)及其亲本株(EIAV LN)env基因导入到杆状病毒基因组中。转染昆虫细胞后,得到的重组病毒用SDS-PAGE和Western blot检测表达产物。以本实验室构建的含有EIAV Env基因的重组痘苗病毒,单独或与重组杆状病毒表达的EIAV Env蛋白联合免疫小鼠。结果:构建的重组杆状病毒能正确表达全长Env蛋白。与单独免疫组相比,联合免疫组免疫应答显著增强,其中中和抗体的滴度提高5～9倍。结论:含有EIAV Env基因的重组痘苗病毒与Env蛋白抗原联合免疫,能够诱导高滴度的中和抗体。

增强子驱动的Cre转基因小鼠的构建及Cre基因的表达鉴定

目的:探索将增强子应用于构建Cre转基因小鼠品系,为以条件基因敲除为基础的基因功能研究提供更多的工具。方法:通过PCR方法从小鼠的细菌人工染色体扩增UH增强子片段,构建含有Hsp68基础启动子、增强子UH、Cre重组酶基因和SV40 polyA的转基因载体pLW400,将3.3 kb的转基因片段通过显微注射导入小鼠受精卵;为了检测Cre在转基因小鼠中的表达,将转基因一代小鼠与纯合子ROSA26报告小鼠(R/R)交配,收集第14 d胚胎期(E14)的舌组织进行LacZ染色检测鉴定。结果:经鉴定,31只子代小鼠中有6只携带外源基因,整合率为19.4%;与R/+对照相比,E14期的双基因型Cre,R/+舌组织为阳性结果(蓝色)。这表明Cre基因在转基因小鼠舌组织内得到表达,并在体内介导ROSA26基因座loxP位点间的重组,且有效删除了2个loxP之间的片段,从而启动了LacZ基因的表达。结论:构建了UH增强子-Hsp68Cre的转基因小鼠,在舌肌中特异表达Cre基因,提示增强子可以被选择应用于Cre转基因小鼠的构建;为舌肌的发育和再生研究奠定了基础。

利用细菌人工染色体同源重组对小鼠基因进行条件型敲除

目的:探索通过细菌人工染色体(BAC)同源重组系统构建条件基因敲除载体的高效率方法,提高条件基因敲除小鼠(Flox小鼠)的构建效率。方法:利用作者自己构建的噬菌体重组酶系统,通过BAC同源重组进行条件型基因敲除载体构建工作。首先通过亚克隆构建了一系列载体含有同源臂的靶向质粒,线性化后,打靶片段经电穿孔法转入大肠杆菌内,与相应的BAC同源重组,再经过三步同源重组和一步位点特异性重组,构建小鼠条件型基因敲除载体。结果:高效率构建了小鼠基因的最终条件基因敲除载体。结论:通过BAC同源重组高效构建条件基因敲除载体,为条件基因敲除载体的构建提供了全新思路,并为FLox小鼠的建立,及相应基因在发育、生理、致病机制等方面的功能研究奠定了基础。

中国CRF01-AE亚型人类免疫缺陷病毒毒株的分子流行病学研究

目的 通过对两次全国范围人类免疫缺陷病毒 (HIV)毒株分子流行病学研究 (NationalMolecularEpidemicStudy ,NMES)中发现的CRF0 1_AE重组HIV 1毒株的分析 ,研究该重组型毒株在我国的流行特点和基因变异特征。方法 从HIV感染者血液中提取前病毒DNA ,使用套式聚合酶链反应 (nested PCR)扩增HIV 1的env基因C2～V4区 ,PCR产物直接测序并使用GCG软件包进行序列分析。结果 到 2 0 0 2年底 ,从全国 31个省市自治区采集的标本中发现CRF0 1_AE重组型样本 16 9份 ,分布在 17个省。虽然CRF0 1_AE重组型仍然以性传播人群为主 [NMES1为 6 2 2 % (2 3/ 37) ,NMES2为5 5 3% (73/ 132 ) ],但吸毒人群中感染该重组型的比例明显增加 ,由NMES1的 2 7% (10 / 37)增加到NMES2的 4 1 6 % (5 7/ 137)。系统树分析可明显看到NMES2吸毒人群流行毒株远离NMES2中性传播人群和NMES1吸毒人群流行毒株。NMES2吸毒人群流行毒株的V3区氨基酸较保守 ,但C3区第 6、8、9、10、12、15、16位氨基酸呈现出规律性变化。结论 CRF0 1_AE亚型已从东南沿海和西南边境扩散至内陆 ,吸毒人群中该亚型比例不断上升。NMES2吸毒人群和NMES1吸毒人群中流行的CRF0 1_AE重组毒株序列明显不同 ,显示其可能有新的来源 ,并呈现扩大流行的态势。

中国HIV-1B/C重组病毒的gag-pol区基因序列特征分析

目的 对 6株中国人类免疫缺陷病毒 1型 (HIV 1)B/C重组病毒的完整 gag基因和部分pol基因进行序列分析 ,从基因水平上分析是否存在新模式的B/C重组病毒并与其母本毒株进行比较研究 ,尝试对其不同的生物学表型进行解释。方法 从确诊的HIV感染者的全血样本中 ,提取样本基因组DNA ,经套式聚合酶链反应 (PCR)扩增后 ,将扩增产物进行纯化和测序。然后将所得序列进行系统进化树和氨基酸变异分析。用Simplot软件进行序列重组分析并确定重组断点区域 ;用MEGA软件按断点分段做基因进化树分析以验证该断点的正确性 ;用GCG软件包的Distance程序计算基因距离。并分析所研究的HIV 1B/C重组毒株长 2 5 5 0bp基因区段的分区段的基因离散率及基因重组对其功能可能造成的影响。结果 新疆 5份样本均未发现重组断点的变化 ,而重庆 1份样本的逆转录酶区内的B/C断点发生了 16 0个核苷酸的移动。氨基酸序列分析显示 ,我国流行的B/C重组株与其母本B、C毒株之间发生第 2 86位 (R→K/N)和第 799位 (A→T)的变化。结论 我国现在流行的HIV 1B/C重组病毒仍以CRF0 7 BC和CRF0 8 BC两种模式为主 ,在本研究涉及的基因区内尚未发现新模式重组毒株的流行。初步分析表明我国B/C重组毒株 2 86位和 799位氨基酸的变异可能为B/C重组株在我?

中国HIV-1主要流行重组株B/CTat基因第一外显子序列特征分析

目的研究我国人类免疫缺陷病毒1型(HIV-1)流行重组株B/CTat基因第一外显子变异特点,探讨这些变化对其功能的影响。方法从确诊的HIV-1感染者全血样本中提取基因组DNA,经套式聚合酶链反应(PCR)扩增和测序。使用GCG和Bioedit软件中的程序进行系统进化树和氨基酸变异分析,同时进行网上三级结构预测。结果总计154份样品中CRF07-BC为120份,CRF08-BC为34份,两种亚型有较广泛的分布,CRF07-BC与标准株的平均基因离散率为(5.748±1.352),CRF08-BC与标准株的平均基因离散率为(1.259±1.931)。结论我国流行重组株CRF07-BC比CRF08-BC有较长的流行时间,CRF07-BC与CRF08-BC基因第一外显子氨基酸相比,主要为半胱氨酸富含区和核心区的变化。在这两个区位点变化可能影响Tat与细胞因子如cyclinT1的结合能力,而成为CRF07-BC在我国流行中获得传播优势的原因。