全球柯萨奇病毒A组6型VP1区进化与正向选择位点分析

目的基于柯萨奇病毒A组6型(coxsackievirus group A type 6,CV-A6)VP1编码区寻找与其流行强度增加有关的关键氨基酸位点。方法对GenBank数据库中全部CV-A6 VP1编码区核苷酸序列进行筛选,获得其中的1533条序列进行比对。使用RAxML软件构建最大似然树。使用Shannon Entropy在线分析工具计算序列的氨基酸置换熵值,并用Datamonkey在线分析平台通过MEME,SLAC和FUBAR三种方法来分析正向选择位点。结果目前全球流行的CV-A6以D3基因亚型为主。在VP1编码区存在三个高度可变的氨基酸位点,分别是VP1-5、VP1-30、VP1-137。三种方法均发现VP1-5、VP1-90、VP1-137三个位点在流行中受到过正向选择的作用。结论应继续加强对D3基因亚型CV-A6的监测,D3基因亚型的CV-A6在位于DE环中的VP1-137高度可变且受到了正向选择的作用,需要加以重视,并通过进一步研究来确定它与D3亚型广泛流行的关系。

柯萨奇病毒B组5型基因分型标准的研究

目的依据肠道病毒分子分型的基本原则(基于VP1区全长核苷酸序列差异界值15%~25%),科学建立柯萨奇病毒B组5型(coxsackievirus B5,CVB5)的分子分型标准。方法本研究依托中国手足口病实验室网络,将来自中国大陆2001—2021年间分离出的69株CVB5采用逆转录-聚合酶链反应扩增全长VP1编码区,并进行核苷酸序列测定和分析;同时下载并筛选GenBank中截至2022年2月16日的742条CVB5全长VP1编码区核苷酸序列(849个核苷酸)。使用MEGA 7.0软件进行序列比对及构建基于最大似然法的基因进化树,自展值设定为1000,进行CVB5分子分型标准的研究。结果69株中国大陆CVB5分离株与CVB5原型株(Faulkner株)核苷酸和氨基酸的相似性分别为77.3%~81.6%和93.2%~95.3%。系统进化树显示,全球CVB5可分为4个不同分支,分支内核苷酸的平均差异范围在7.3%~13.4%,氨基酸的平均差异范围在1.9%~3.3%,分支间核苷酸的平均差异范围在17.0%~22.3%,氨基酸的平均差异范围为4.2%~4.9%。根据上述分子分型标准,将全球CVB5划分为A、B、C、D四个基因型。A基因型和C基因型CVB5可能在进化过程中已消失,不再流行,而B基因型和D基因型CVB5目前在全球呈现共流行趋势。中国大陆流行的CVB5主要为D基因型,少部分为B基因型。结论本研究建立了CVB5的分子分型的标准,并根据该标准将全球CVB5划分为4个基因型,对进一步了解CVB5的遗传变异变迁规律和进行分子溯源具有重要意义。

2017-2018重庆市手足口病病原谱及主要病原体基因特征分析

目的分析2017—2018年重庆地区手足口病病原谱及其主要病原体的基因特征。方法选择重庆市儿童医院作为研究对象,收集并整理该院区2017—2018年1071例诊断为手足口病患者的核酸检测信息,其中810份已明确了肠道病毒血清型,剩余175份血清型待鉴定,另有86份肠道病毒为阴性。通过病毒分离、核酸浓缩及基因测序等方法对上述261份样本进行鉴定,获得该地区手足口病完整的病原谱。使用MEGA 7.0软件构建四种主要病原体的系统进化树,进行基因特征的研究。结果通过改良的鉴定方法,261份标本中,除3份被鉴定为人副肠孤病毒(Human parechovirus,HPeV)外,其余258份样本均为肠道病毒阳性。其中CVA6(coxsackievirus A6)血清型占比最多,其次为EV-A71(enterovirus A71)另有CVA16(coxsackievirus A16)和CVA10(coxsackievirus A10)以及其他肠道病毒共计13种血清型。系统进化结果显示,重庆市CVA6血清型均为D3a基因亚型,EV-A71、CVA10和CVA16的优势基因亚型分别为C4a,C2b和B1b,这四种优势基因型与全国其他地区的基因型共同循环进化。结论本研究通过优化鉴定方法,提高了肠道病毒的检出率,进一步明确了重庆地区手足口病病原谱构成,CVA6是该地区2017—2018年手足口病的主要病原体,其次是EV-A71,同时这两种血清型也是导致重庆地区重症手足口病主要的病原体。

中国CVA6 D3基因亚型B细胞抗原表位氨基酸差异分析及VLPs初步制备

目的分析中国流行的柯萨奇病毒A6型(coxsackievirus A6,CVA6)D3基因亚型中的D3a和D3b分支序列结构蛋白B细胞抗原表位氨基酸差异性来优化设计CVA6病毒样颗粒(virus-like particle,VLP)疫苗。方法对GenBank下载的含有P1区核苷酸CVA6序列,使用MEGA.11.0软件基于VP1序列采用最大似然法构建进化树划分基因型及亚型。采用在线工具WebLogo并结合CVA6 B细胞抗原表位研究的相关文献,对D3a和D3b分支序列VP1-VP3区B细胞抗原表位氨基酸差异性分析,为筛选疫苗候选株进行CVA6 VLP的制备。结果D3a与D3b分支序列在VP1 N末端P27位点分别是天冬酰胺(96.2%)和丝氨酸(92.9%);在VP3 N末端P60位点为甘氨酸(98.8%)和丝氨酸(60.0%)。基于上述差异性选择具有D3a(VP3-N-P60)和D3b(VP1-N-P27)两分支序列共有的B细胞抗原表位D3a-JX2018(GenBank accession number:MN845862)作为疫苗候选株,并成功制备了CVA6 VLP。结论本研究为疫苗候选株的选择提供了新的思路,为日后CVA6 VLPs疫苗和免疫诊断试剂的研发提供了基础。