云南省澜沧江下游地区虫媒病毒的调查研究

目的 了解云南澜沧江下游地区自然界虫媒病毒流行情况。方法 从云南澜沧江下游地区(澜沧县和思茅市)所属乡村采集蚊虫,分类后保存于液氮。经消毒、研磨、离心等处理后接种组织培养细胞分离病毒,并进行初步鉴定。结果从233份标本中,分离到22株致C6/36细胞病变的病毒,表现为细胞圆化、聚集、脱落。分离阳性率为9.4％(22/233)。经鉴定10株对乙醚和5’-磺脱氧尿苷抵抗,为无包膜双链RNA病毒,核酸电泳为12节段RNA病毒。9株对乙醚敏感,对5’-碘脱氧尿苷抵抗,为有膜RNA病毒,核酸电泳为10条带。Colti病毒95-75单克隆抗体与新分离的12节段RNA病毒的酶联免疫吸附试验(ELISA)和免疫荧光试验呈阳性反应,而与10节段病毒呈阴性反应。3株病毒为对乙醚敏感,其中1株被乙型脑炎病毒A2株免疫腹水中和,并与A2免疫腹水荧光试验呈阳性反应;1株(云南92-4)与布尼亚病毒组特异免疫腹水的荧光试验和ELISA试验均为强阳性,而与甲病毒组特异性免疫腹水及黄病毒组的乙型脑炎病毒免疫腹水均呈阴性反应;经负染在电镜下观察毒粒呈圆形,直径约为(87.00±0.05)nm。外层可见表面突起。结论 从云南澜沧江下游地区采集的蚊标本分离到10株Colti病毒,9株环状病毒,1株为乙脑病毒,1株为布尼亚病毒,1株尚在研究中。

以新型杆状病毒载体在昆虫、哺乳动物细胞中表达克里米亚-刚果出血热病毒核蛋白基因

目的 构建可以在哺乳动物细胞中高效表达的新型杆状病毒载体 ,并利用其将克里米亚 刚果出血热病毒 (CCHFV)中国分离株 (新疆出血热病毒 ,XHFV)BA8816 6的核蛋白 (NP)基因在昆虫和哺乳动物细胞中进行表达。方法 将人巨细胞病毒 (CMV)立即早期 (IE)启动子连接至杆状病毒载体pFastBac1多角体启动子下游形成新载体pCB1,然后将XHFVNP基因克隆至该载体 ,通过重组质粒转染和病毒感染 ,检测其在哺乳动物细胞 (COS 7和Vero)及昆虫细胞中的表达。结果 连接至pCB1的XHFVNP基因均能在相应的细胞中获得良好表达 ;以重组杆状病毒感染的Vero细胞可以作为抗原检测XHF血清 ,与ELISA的检测结果完全一致 ,并与临床诊断有很好的平行性。结论 新型杆状病毒载体能够驱动外源基因在昆虫和哺乳动物细胞中高效表达 ,不仅能方便快速地制备诊断抗原 ,还具有发展重组病毒疫苗和基因治疗的潜力。

人源腺病毒伴随病毒Ⅱ型单克隆抗体Fab段及其全抗体的研制

目的 运用噬菌体表面表达技术 ,获得基因工程抗腺病毒伴随病毒抗体Fab、IgG。方法 从酶联免疫吸附试验阳性的人外周血中分离淋巴细胞 ,提取总RNA ,逆转录cDNA ,聚合酶链反应扩增人IgGFab轻、重链基因 ,利用pComb3载体构建噬菌体抗体库。用纯化的腺病毒伴随病毒为固相抗原筛选抗体Fab段 ,并在E coli中进行分泌性表达。通过ELISA和间接免疫荧光试验、筛选和鉴定Fab抗体 ,并进行序列测定。然后将其重链和轻链基因克隆到全抗体表达载体pAC L Fc上 ,转染昆虫sf 9细胞 ,利用杆状病毒 昆虫细胞系统实现全抗体的分泌型表达 ,免疫沉淀试验鉴定它的抗蛋白。结果 分离到一株Fab克隆AAVs 31,腺病毒伴随病毒抗原和抗Fab抗体直接ELISA检测阳性 ,间接免疫荧光试验呈阳性 ,序列分析结果表明是一新的序列 ,所获得的基因为人源IgGFab基因 ,由Gamma链和Kappa链组成。表达的全抗体ELISA反应、免疫荧光反应和间接免疫荧光试验均为阳性 ,免疫沉淀试验结果显示它结合病毒颗粒 ,不结合任一VP1、VP2、VP3单独衣鞘蛋白。结论 用噬菌体表面表达技术首次获得了抗腺病毒伴随病毒Ⅱ型单克隆抗体Fab段 ,并在真核系统中表达了其全抗体 。