共表达HPV16L1、L2、E67蛋白的重组非复制型痘苗病毒的构建

目的:构建共表达人乳头瘤病毒16型(HPV16)L1、L2、E67蛋白的非复制型重组痘苗病毒人用疫苗株。方法:以痘苗病毒为载体、利用同源重组技术筛选共表达HPV16L1、L2、E67蛋白的重组痘苗病毒并对其进行鉴定。结果:该病毒在CEF细胞上连续传至第15代,经斑点杂交结果表明重组病毒基因组中有L1、L2、E6、E7基因插入;经Westernblot检测,重组病毒能稳定表达HPV16L1、L2、E67蛋白。结论:非复制型重组痘苗病毒NTVJE67CKL1L2可作为预防和治疗HPV16相关肿瘤及其癌前病变的候选疫苗。

猴痘病毒A29L、B6R、M1R蛋白的表达纯化及其在痘苗病毒免疫血清检测中的应用分析

目的表达纯化猴痘病毒A29L、B6R以及M1R抗原蛋白并分析三种蛋白在痘苗病毒免疫血清检测中的应用。方法将猴痘病毒A29L、B6R以及M1R抗原按照人源密码子优化合成后插入pVRC载体,转染HEK293T细胞后收获上清,通过Western blot方法验证蛋白表达,通过镍柱和离子交换层析柱纯化蛋白,并采用SDS-PAGE和考马斯亮蓝染色鉴定蛋白纯度。分别以纯化A29L、B6R与M1R作为包被抗原,通过ELISA检测痘苗病毒免疫后的小鼠、恒河猴与人血清中IgG抗体滴度,并分析它们与血清中抗痘苗病毒、抗猴痘病毒中和抗体滴度的相关性。结果猴痘病毒A29L、B6R、M1R蛋白在细胞上清中均可大量分泌表达。经镍柱及离子交换层析柱进行蛋白纯化后,纯度均可达90%以上。痘苗病毒免疫的动物与人血清中均可检出针对三种蛋白特异的IgG抗体,三个抗原检测的IgG滴度显著相关,痘苗免疫血清中A29L、B6R、M1R特异的IgG与抗痘苗病毒中和抗体水平也显著相关,但与抗猴痘病毒特异中和抗体水平相关性较弱。结论在痘苗病毒免疫血清中可检测到与猴痘病毒A29L、B6R、M1R蛋白交叉反应的IgG抗体,且IgG滴度与抗痘苗病毒中和抗体水平显著相关,但与猴痘病毒特异中和抗体水平相关性较弱。该研究可为正痘(包括猴痘)病毒免疫学检测方法的应用及疫苗研发提供参考。

水痘-带状疱疹病毒滴定方法的优化与应用评价

目的对水痘-带状疱疹病毒(varicella-zoster virus,VZV)病毒滴定方法进行优化,并应用于中和抗体检测和抗病毒药物体外检测。方法采用VZV疫苗株Voka株在48孔板感染人视网膜上皮细胞(adult retinal pigment epithelial cell line-19,ARPE-19),连续7 d检测感染后病毒复制动力学与蚀斑特点;分别建立并优化活病毒滴定的蚀斑染色法和酶联免疫斑点法(enzyme linked immunospot assay,ELISPOT),同时对两种方法检测结果的相关性进行分析,并将改进后的方法应用于VZV药物抑制效果检测和血清中和抗体检测。结果VZV感染ARPE-19细胞(感染复数为0.05)后,第6天到达复制顶峰并形成肉眼可见蚀斑;蚀斑染色法中,添加0.2 mg/mL二乙胺乙基葡聚糖(diethylaminoethyl-dextran,DEAE-Dextran)后,较未添加组产生更大与边缘更加清晰的蚀斑。ELISPOT法可在感染后第3天进行计数,同时通过改变检测用抗体与显色液等,可产生更加清晰可计的斑点。两种方法可采用机器计数,检测病毒滴度或应用于体外检测抗VZV药物效力与血清中和抗体滴度,具有良好的相关性。结论优化后ELISPOT法快捷灵敏,可替代蚀斑染色法应用于VZV病毒滴度检测与相关应用。本研究为VZV的检测及疫苗药物研发提供了更简捷可靠的实验方法。

儿童肺炎肺实变住院患儿支气管肺泡灌洗液病原分析

本研究分析肺炎肺实变患儿支气管肺泡灌洗液病原谱构成,旨在为临床经验性抗感染治疗提供指导。收集2019年1月—2020年1月复旦大学附属儿科医院纤维支气管镜室诊治的住院肺炎病例临床资料,其中肺实变的诊断基于影像学证据,依托国家儿童医学中心病原学检测平台,并参考感染传染科医生解读,本研究对肺炎伴肺实变患儿支气管肺泡灌洗液标本的病原学检测结果进行回顾性分析。结果显示,286例肺炎患儿的286份支气管肺泡灌洗液标本被纳入研究,平均年龄5.5(5.8±3.1)岁,其中195例(68.2%)存在肺炎伴肺实变。总病原体检出率为76.6%(219/286),肺实变和无肺实变肺炎患儿病原体检出率分别为77.9%(152/195)和73.6%(67/91),差异无统计学意义;检出的前5种病原体均为肺炎支原体、腺病毒、鼻病毒、呼吸道合胞病毒和副流感病毒3型。5周岁及以上患儿肺炎支原体检出率达最高77.0%(127/165),肺实变病例和无肺实变病例肺炎支原体检出率分别为67.2%(131/195)和61.5%(56/91),差异无统计学意义。本研究结果提示,肺炎支原体、腺病毒、鼻病毒、呼吸道合胞病毒和副流感病毒3型是导致本研究目标人群患病的主要病原体;病原体检出率高低与是否肺实变无关。

重症急性呼吸道感染儿童中人腺病毒感染的型别分布及其流行病学特征

腺病毒是Rowe等于1953年在人的腺样组织中被发现，并因此而得名。人腺病毒感染在全球范围广泛流行，可引起多种疾病。其分型检测主要方法是PCR结合测序。国内外关于婴幼儿急性呼吸道感染中腺病毒的检测及临床特征的分析已有不少报道，但多数研究不进行具体分型分析，且对于近年来我国严重急性呼吸道感染（severe acute respiratory infection, SARI）住院儿童中人腺病毒的分型分布及相关流行病学特点的研究较少。为此，本研究对来自北京某儿童医院内SARI住院儿童鼻咽抽吸物进行人腺病毒的分型检测与分析。

北京、上海严重急性呼吸道感染儿童中肠道病毒D68的检出与基因特征分析

为了解肠病毒D68（EV-D68）在北京、上海地区严重急性呼吸道感染（SARI）儿童中的流行情况和分子特征。本研究采集2008～2010年北京儿童医院SARI儿童呼吸道样品259份,2013～2014年上海复旦大学附属儿科医院SARI儿童呼吸道样品441份,采用套式RT-PCR结合测序方法检测筛选EV-D68阳性样品,设计EV-D68全基因组通用引物,对EV-D68阳性样品进行全基因组扩增,收集NCBI核酸数据库中目前所有的EV-D68全基因组序列进行序列分析,比较EV-D68中国和美国流行株的差异。结果发现：北京地区检测EV-D68阳性样品1例,阳性率为0.4%,上海地区检测EV-D68阳性样品4例,阳性率为0.9%。结合目前中国已上传的所有EV-D68相关序列,分析表明：目前中国地区流行的EV-D68主要属于Clade A2或Clade B2亚型,不同于美国的Clade A1、Clade B1、Clade B4和Clade B5亚型,另外EV-D68部分基因进化分析时出现树形结构冲突现象;上述结果表明目前EVD68在北京、上海地区的SARI儿童群体中的感染率较低（5/700;〈1%）;中国与美国流行的EV-D68毒株属于不同的分支,差异较大,部分序列分析表明EV-D68病毒可能存在组内重组现象。

上海市重症急性呼吸道感染儿童中可检出多种型别的人腺病毒

目的了解上海市重症急性呼吸道感染（SARI）儿童中人腺病毒（HAdV）的感染情况及其分型特征。方法2013年6月至2014年3月从上海复旦大学附属儿科医院收集441份重症急性呼吸道感染患儿鼻咽抽吸物（NPAs）。采用巢式PCR的方法进行人腺病毒的检测，对阳性样本进行分型分析及基本流行病学特征分析。结果人腺病毒共检出51例（11．6％，95％CI8．6％～14．6％）阳性，以0．5—1岁之间的患儿感染率较高，分型分析发现感染者中B组所占比例最高，共33例（64．7％），其中HAdV-3共17例（33．3％），HAdV-7共检出16例（31．4％）；其次为C组共14例（27．5％）；HAdV—D（HAdV-8）与HAdV—E（HAdV-4）各1例；HAdV—F（HAdV-41）检出2例。结论人腺病毒在上海市重症急性呼吸道感染患儿中有较高的感染率．存在多种基因型且以HAdV—B中的HAdV．3、7型感染最为常见。

重症急性呼吸道感染儿童中人博卡病毒的分型检测与基因进化分析

目的 了解重症急性呼吸道感染住院儿童中人博卡病毒（HBoV）的感染状况,流行病学特征及其进化特征.方法 采用巢式PCR的方法,对来自北京儿童医院重症急性呼吸道感染住院儿童的259份鼻咽抽吸物,进行人博卡病毒（HBoV）分型检测与测序,同时进行了合并感染检测、流行病学、临床特点及基因多态性分析.结果 共检出56份人博卡病毒感染阳性标本,阳性率为21.6％,[95％ CI（16.0％～27.3％）,P＜0.0001],其中2岁以下儿童感染率较高.与其他呼吸道常见病毒的合并感染率为94.6％.HBoV阳性产物测序分析发现,人博卡病毒1型占96.4％ （54/56）,2、3型各1份.HBoV阳性株分型区（VP1/VP2）序列变异不明显.结论 人博卡病毒是儿童急性呼吸道感染常见的病原体,以I型最为常见,分型区（VP1/VP2）序列较保守.HBoV在重症急性呼吸道感染儿童中是否起到真正的致病作用还需进一步的研究.

密码子优化的HPV16 L2E7基因在大肠杆菌中高效表达

目的提高HPV16L2E7融合基因在大肠杆菌中的表达水平,为中试研究提供高表达量的疫苗候选株。方法根据大肠杆菌偏爱密码子,利用Synthetic Gene Designer软件对L2E7全基因进行密码子优化,将分段合成的基因分部插入到pET9a中,经酶切和测序鉴定无误后转化BL21(DE3+)中,用异丙基-β-D硫代半乳糖苷(IPTG)诱导表达。表达的融合蛋白进行SDS-PAGE胶和Western blot鉴定。同时还进行梯度实验分别对诱导的温度、时间和IPTG诱导时菌体浓度进行优化,并对蛋白的纯化方案进行摸索。结果优化后的pET9aSL2E7AB在大肠杆菌中得到高效表达,诱导条件优化后的目的蛋白占全菌60%左右。结论成功得到了具有较高表达水平的疫苗候选株。

中东呼吸综合征冠状病毒感染的流行病学进展

中东呼吸综合征冠状病毒(middle east respiratory syndrome coronavirus,MERS-CoV)能引起人的下呼吸道感染,病死率高,对全球公共卫生造成了威胁。从2012年发现MERS-CoV至今,已经有26个国家出现过MERS-CoV病毒感染,截至2016年2月19日WHO报告的实验室确诊病例有1 638例,其中死亡病例587例。本综述对MERS-CoV的一般病毒学特点、致病机制进行了阐述,同时对MERS-CoV与严重急性呼吸系统综合征冠状病毒的流行病学特点进行了比较。

共表达HPV16L1、L2、E6、E7蛋白的重组非复制型痘苗病毒构建及鉴定

目的构建共表达人乳头瘤病毒16型(HPV16)L1、L2、E6、E7蛋白的非复制型重组痘苗病毒人用疫苗株。方法以痘苗病毒为载体、利用同源重组技术筛选共表达HPV16L1、L2、E6、E7蛋白的重组痘苗病毒并对其进行鉴定。结果该病毒在CEF细胞上连续传至第15代,经斑点杂交结果表明重组病毒基因组中有L1、L2、E6、E7基因插入;经WesternBlot检测,重组病毒能稳定表达HPV16L1、L2、E6、E7蛋白。结论非复制型重组痘苗病毒NTVJE6E7CKL1L2可作为预防和治疗HPV16相关肿瘤及其癌前病变候选疫苗。

HPV16型重组疫苗的构建及其抗肿瘤效果

背景与目的大量研究表明,宫颈癌的发生与高危型人乳头状瘤病毒(humanpapillomavirus,HPV)的感染密切相关,其中以HPV16为主。本研究以非复制型重组痘苗病毒为载体,构建共表达HPV16L1、L2、E67蛋白的重组非复制型痘苗病毒,并检测其免疫效果。方法以痘苗病毒为载体,利用同源重组技术构建共表达HPV16L1、L2、E67基因的重组痘苗病毒NTVJE67CKL1L2。用该病毒免疫C57BL/6小鼠后,检测其特异性抗体和特异性的细胞毒性T淋巴细胞(cytotoxicTlymphocyte,CTL);以TC-1肿瘤细胞攻击经免疫后的小鼠,观察其免疫保护效果。结果经斑点杂交结果显示重组病毒基因组中有L1、L2、E6、E7基因插入;经Westernblot检测,重组病毒能稳定表达HPV16L1、L2、E67蛋白。动物实验结果表明,NTVJE67CKL1L2在C57BL/6小鼠体内可诱发L1、L2、E67特异性抗体产生;可诱发产生针对TC-1细胞的特异性的CTL反应;加强免疫后的小鼠能耐受1×104个TC-1肿瘤细胞的攻击。结论非复制型重组痘苗病毒NTVJE67CKL1L2可以作为对HPV16相关肿瘤及其癌前病变进行免疫治疗的候选疫苗。

流感病毒RNA聚合酶蛋白PB1在小鼠中可诱导亚型间交叉免疫保护

目的探索流感病毒RNA聚合酶PB2和PB1亚基作为实验性流感疫苗候选抗原的可能性。方法以复制型质粒(pSCA)为载体分别构建表达甲1型和甲3型流感PB2和PB1的复制型 DNA疫苗,免疫小鼠后分别用甲1型流感病毒(A/PR／8／34)进行鼻腔攻击,观察针对不同亚型流感病毒的复制型DNA疫苗的免疫保护效果。结果本实验所构建的复制型DNA疫苗在真核细胞中均可表达外源基因;本实验采用的复制型质粒载体(pSCA)与传统质粒载体(pcDNA3)在诱导小鼠产生抗体方面无差异,并且都诱导了偏向T_H1类的免疫反应;表达甲1型和甲3型流感PB1基因的复制型DNA 疫苗均可保护小鼠抵御甲1型流感病毒(A/PR／8／34)的攻击。结论表达甲型流感病毒PB1的复制型 DNA疫苗能保护小鼠抵御同型和异型流感病毒的攻击,本实验为流感疫苗研究提供新的候选抗原。

新近发现的细小病毒与多瘤病毒感染

2005年以来，研究人员又相继发现了新的与人类疾病相关的DNA病毒，包括属于细小病毒科的人博卡病毒（humanbocavirus，HBoV，2005年）、人细小病毒4（humanparvovirus4，PARV4，2005年）与人细小病毒5（humanparvovirus5，PARV5，2006年[33）；属于多瘤病毒科的KI多瘤病毒（KIpolyomavirus，KIPyV，2007年）、wu多瘤病毒（wupolyomavirus，WUPyV，2007年）及MC多瘤病毒（MCPolyomavirus，MCPyV，2008年）等。

一种新型冠状病毒荧光定量PCR快速检测方法的应用评价

目的建立并评价一种基于COYOTE■Flash20实时荧光定量PCR仪用于新型冠状病毒(SARS-CoV-2)核酸快速检测的方法。方法通过使用靶向SARS-CoV-2 ORF1ab和N基因的特异性引物探针组构建快速反应体系,并验证体系的灵敏度和特异性。同时,使用108例新型冠状病毒肺炎(COVID-19)临床样本对该方法进行应用评估。结果该检测方法无需核酸提取、手动操作时间仅用1 min,样本进、结果出,可以在30 min完成检测。该方法最低检测限为4×10^(2)拷贝/ml;与其他人类冠状病毒(包括HCoV-229E、HCoV-NL63、HCoV-OC43、HCoV-HKU1、SARS-CoV和MERS-CoV)以及其他引起呼吸系统疾病的病毒无交叉反应。临床样本应用评估显示,与常规需要核酸提取的RT-qPCR的总符合率为98.15%。结论通过对SARS-CoV-2快速荧光定量PCR方法的应用评价发现,该方法操作简便、快速、特异、灵敏,适用于多种场景即时快速检测需求。

基于毛细管电泳的快速检测七种人冠状病毒技术方法的建立

近来,一种新型冠状病毒(SARS-CoV-2)引发的COVID-19突发疫情,给全球公众健康和社会经济构成严重威胁。SARS-CoV-2成为继人冠状病毒229E(Human coronavirus 229E,HCoV-229E)、人冠状病毒OC43(Human coronavirus OC43,HCoV-OC43)、严重急性呼吸综合征冠状病毒(Severe acute respiratory syndrome coronavirus,SARS-CoV)、人冠状病毒NL63(Human coronavirus NL63,HCoV-NL63)、人冠状病毒HKU1(Human coronavirus HKU1,HCoV-HKU1)和中东呼吸综合征冠状病毒(Middle East respiratory syndrome coronavirus,MERS-CoV)后第七种感染人类的冠状病毒。本研究以高分辨毛细管电泳技术为基础,针对七种人冠状病毒基因保守区分别设计特异性引物对,经常规PCR扩增后,通过具备单碱基差异分辨率的毛细管电泳分析,实现快速检测七种人冠状病毒的目标。通过构建基于毛细管电泳的人冠状病毒分子靶标,实现同时快速精准鉴定七种人冠状病毒的目的。本研究建立的人冠状病毒毛细管电泳快速检测技术方法具有极高灵敏性和精确性,分辨率高而且特异性好,操作简便成本低廉,为人冠状病毒的临床诊断、口岸快速检测等提供了新的技术支持。

HPV11型L2E7融合蛋白的原核表达及其免疫效果观察

目的构建人乳头瘤病毒11型L2E7原核表达系统pET9aHPV11L2E7，并纯化蛋白进行小鼠免疫效果研究。方法从尖锐湿疣组织中扩增人乳头瘤病毒11型12、E7基因片段，构建DET9aHPV11L2E7原核表达重组质粒并测序，在大肠埃希菌宿主菌BL21（DE3＋）中经IPTG诱导表达融合蛋白L2E7（553个氨基酸），经SDS—PAGE电泳和Western Blot进行鉴定。CM离子交换介质纯化蛋白免疫BALB／c小鼠，进行细胞免疫水平和体液免疫水平的检测。结果成功构建了pET9 aHPV11L2E7原核表达系统，纯化获得的HPV11L2E7蛋白免疫BALB／c小鼠后能检测到针对HPV11E7特异性的细胞免疫，血清中能检测到高效价抗HPV11L2E7抗体。结论纯化的HPV11L2E7融合蛋白能够引发特异性细胞和体液免疫反应，能作为尖锐湿疣免疫治疗候选疫苗。

人禽流感酶联免疫诊断方法的建立及其初步应用

目的建立人禽流感H5抗体的酶联免疫检测方法（ELISA）。方法用ELISA法检测疑似高致病性禽流感患者及正常人群血清标本中H5IgG抗体。结果23例疑似高致病性禽流感患者血清样品中有4例H5IsG抗体阳性，阳性率为17．40％，与血凝抑制试验（HI）和微量中和试验（NI）相比较，三者符和率为100％。234例正常人群血清H5 IgG抗体检测均为阴性。结论建立的ELISA方法可用于高致病性人禽流感的血清样品初步筛查。