PrP的胞内运输与朊病毒病

朊病毒病,即传染性海绵状脑病(transmissiblespongiformencephalopathies,TSEs),是一类致死性的神经退行性疾病,存在散发性、感染性和遗传性3种形式。在朊病毒病的病理过程中,细胞正常朊蛋白PrPC(cellularPrP)转化为异常构象的PrPSc(scrapiePrP)是至关重要的,但是朊病毒的增殖如何导致神经元凋亡仍不清楚。PrPC的胞内运输在朊病毒病中发挥重要作用,朊病毒感染后PrPC转化为PrPSc,及遗传性朊病毒病中PrP突变可能影响PrP的生物合成、亚细胞定位及转运过程,通过干扰PrPC的正常功能或产生毒性中间体而导致神经系统病变。现对近年来关于PrP胞内运输在朊病毒病中的作用进行综述。

遗传性朊病毒病额叶脑组织差异蛋白质组学研究

目的 应用蛋白质组学方法,筛选遗传性朊病毒病（Prion disease）额中回皮质差异表达蛋白以探究朊病毒病的发病机制和干预靶点.方法 对我国经临床、病理及分子生物学方法确诊的3例遗传性朊病毒病尸检脑组织额中回皮质,以3例同年龄组的心脏猝死且无神经系统病变的尸检脑组织为对照,进行了差异蛋白质组研究.应用荧光双向差异凝胶蛋白电泳、MALDI-TOF/MS串联质谱仪进行差异蛋白质谱分析.Mascot search results软件进行搜库,确定差异表达蛋白.结果 表达上调的蛋白有：半乳糖凝集素-1（Galectin-1,Gal-1）;泛素（Ubiquitin）;兰尼碱受体2（Ryanodine receptor 2,RyR2）;肌动蛋白结合蛋白（Profilin-2,PFN2）;Rab相互作用溶酶体蛋白样蛋白-1（Rab-interacting lysomes protein-like protein 1,RILPL-1）;髓鞘碱性蛋白异构体4（Isoform 4 of myelin basic protein）;表达下调的蛋白是血色素β亚单位（Hemoglobin subunit beta）.结论 结合文献分析其中泛素、Gal-1、RyR、PFN2和RILPL-1可能与遗传性朊病毒病发病机制关系更为密切.Gal-1可能在朊病毒病中发挥内源性神经保护机制;RyR2与记忆及肌阵挛有关;泛素、RILP-1与错误折叠蛋白质清除有关;PFN2可能与神经变性病的轴浆运输障碍有关.

经典Wnt/β-catenin信号通路在朊病毒感染细胞模型SMB-S15中抑制的研究

目的 检测经典Wnt/β-catenin信号通路在朊病毒感染的细胞模型SMB-S15中的功能状态.方法 运用real time-PCR方法检测了朊病毒感染的细胞模型SMB-S15中,经典Wnt/β-catenin信号通路调控的靶基因mRNA表达水平;应用Western Blot方法检测稳定感染羊瘙痒因子Chandler株的小鼠神经细胞系SMB-S15中经典Wnt/β-catenin信号通路的相关调控蛋白及靶蛋白的表达.结果 与磷酸戊聚糖治愈的细胞对照SMB-PS相比,SMB-S15细胞中经典Wnt信号通路的靶基因cyclin D1、c-myc、survivin转录水平均有显著下调.经典Wnt信号通路的调控蛋白中,磷酸化p-catenin （Ser33,37,Thr41）表达明显上调,且其靶基因cyclin D1的蛋白表达明显下调,失活形式磷酸化糖原合成激酶（GSK-3β Ser9）表达明显下调.结论 在朊病毒感染的细胞模型SMB-S15中经典Wnt/β-catenin信号通路被抑制.

线粒体功能异常与朊病毒病的关系

朊病毒病也称传播性海绵状脑病(TSEs),是一类罕见的致死性神经退行性疾病,包括人的克雅病(CJD)、库鲁病(Kuru)、家族型致死性失眠症(FFI)、牛海绵状脑病(BSE)和羊瘙痒病(Scrapie)等。朊病毒病临床上表现为进行性共济失调、震颤、认知障碍,最终导致死亡,病理特征为中枢神经系统出现海绵样变、神经元丢失和神经胶质细胞增生等特征性改变。

羊瘙痒因子263K经多种途径感染仓鼠的脑外组织PrP^(Sc)分子和沉积特点研究

目的 比较研究实验仓鼠经不同途径感染羊瘙痒病 (Scrapie)毒株 2 6 3K的终末期病鼠脑外组织内PrPSc分子和沉积特点。方法 以Scrapie 2 6 3K毒株经颅内、腹腔、心内、肌肉注射及灌胃等途径接种金黄地鼠 ,在终末期取脑、脊髓、脾、肾、舌、肌肉、小肠回盲部和胃组织 ,用HE染色观察病理变化 ,免疫组化法检测PrPSc的组织沉积特点 ,Westernblot检测PrPSc分子特征。结果 五种感染方式均可引起动物发病 ,在脑和脊髓组织中观察到典型的病理改变 ;PrPSc免疫组化检测显示外周途径感染动物脊髓白质内有大量沿纤维走行的PrPSc沉积 ,灰质前后角内围绕空泡点状或网状沉积 ,而颅内感染主要在中央管附近和后角出现大量的点状PrPSc沉积 ;脾脏、肾、小肠回盲部、胃组织中均观察到点状PrPSc的沉积 ;WesternBlot检测发现不同感染途径动物脊髓提取物均出现可抵抗蛋白酶消化的PrPSc条带 ,与脑提取物中PrPSc电泳性状完全一致 ;外周组织仅在脾脏检测到抵抗蛋白酶消化的PrPSc,但与正常对照比较 ,各种组织中PrP的总量明显增高 ,同时呈现与中枢神经组织不同的PrP电泳特征。结论 在TSE感染发病过程中 ,多种组织细胞成分可能参与了TSE感染因子的向中枢神经系统传递过程 。

血管内皮生长因子(VEGF)单克隆抗体的制备及鉴定

目的:制备血管内皮生长因子(VEGF)单克隆抗体(mAb),并对其特性进行鉴定。方法:以重组His-Trx-VEGF1-165蛋白为抗原,通过免疫、融合、克隆和筛选等方法制备VEGF mAb,制备小鼠腹水并测定其效价、染色体数目及免疫球蛋白亚类,用Western blot方法分析其特异性。结果:成功筛选出能稳定分泌的VEGF mAb杂交瘤细胞株4E4-H5,制备腹水的ELISA效价为1∶106;染色体数目为105条;抗体分型为IgG1亚型,κ轻链;Western blot证实所获得的mAb可与VEGF全长蛋白发生特异性反应,但是与融合蛋白的标签蛋白His-Trx不发生反应。结论:制备的杂交瘤细胞株能稳定分泌高滴度和高特异性的VEGF mAb,为建立能够用于肝癌诊断的血清VEGF检测技术提供了参考。

PRNP基因八肽重复突变研究进展

某些遗传性朊病毒病,例如,家族性Creutzfeldt-Jakob病(fCJD)、GSS综合征均与PRNP基因八肽重复区插入突变相关。关于插入突变Prp分子的研究对于揭示遗传性朊病毒病发病机制具有重要意义。

我国96例散发型克雅氏病患者随访调查及生存分析

目的了解中国散发型克雅氏病(sporadic Creutzfeldt-Jakob disease,sCJD)患者生存情况及生存时间。方法选择2008年1月1日至2011年12月31日期间经我国CJD监测网络诊断的96例sCJD患者,对其家属进行电话随访,获得生存情况及死亡时间。同时从全国死因监测系统中补充患者相关资料,分析可能影响生存时间的因素。结果 96例sCJD患者全部在2年内死亡,其中位生存时间为6.1个月,生存时间短于3、6、12、24个月的累计百分比分别为15.6%、42.7%、74.0%和100%;首发症状、出现典型临床表现的数量对患者生存时间没有明显影响。结论中国sCJD患者的中位生存时间为6.1个月,整体生存时间<2年。

PrP蛋白的表达与头颈部鳞状细胞癌患者临床进展及病理分级的关系

目的 了解头颈部鳞状细胞癌患者PrP蛋白的表达与临床进展及病理分级的关系.方法 在92例临床诊断的头颈部鳞状细胞癌患者中,通过免疫组化的方法对PrP蛋白在组织中的表达进行检测,同时对PrP蛋白与患者临床进展及病理分级程度的关系进行统计学分析.结果 在92例临床诊断的头颈部鳞状细胞癌患者中,PrP蛋白在肿瘤发生的不同部位其阳性率不同,随着患者的临床病程的进展其阳性率增高,随着肿瘤的病理分级的严重其阳性率增高.结论 PrP蛋白的高表达与头颈部鳞状细胞癌的发生、发展具有一定的相关性.

超声处理对羊瘙痒病脑组织中PrP^(Sc)聚集状态的影响

目的 研究超声处理对感染羊瘙痒症仓鼠脑组织中PrPSc聚集状态的影响 ,寻找产生PrPSc低聚体的条件。方法 裂解液制备脑组织提取物 ,用各种超声条件处理不同阶段的脑组织提取物 ;以蛋白酶消化后的Westernblot方法和图象分析系统观测PrPSc蛋白的分布和聚集状态。结果 适当的超声处理 (15s共 30次 )可增加脑组织匀浆上清中PrPSc含量 1 2 9～ 1 5 8倍 ;同样条件下超声处理可明显增加羊瘙痒因子 2 6 3K感染仓鼠脑组织匀浆上清中PrP蛋白总量 ,而对正常对照仓鼠脑组织匀浆上清中PrP蛋白总量影响不大 ;对经常规高速离心获得的PrPSc的超声处理显示约 90 %的PrPSc存在于离心上清液中。结论 对感染动物脑组织进行超声处理可增加PrPSc 的提取量 ,利于实验室检测。适当的超声处理可破碎大的相对分子质量的PrPSc聚集物 ,产生小的相对分子质量的PrPSc产物。

致死性家族失眠症脑组织基因表达谱特点分析

目的研究致死性家族失眠症(FFI)脑组织基因表达谱特点。方法取3例FFI患者丘脑组织按照标准流程制备生物素标记的互补RNA,以正常人丘脑RNA为对照,利用人类基因组芯片U133+2.0检测FFI患者丘脑中差异表达基因,并分析差异基因表达特点。结果共有1 314个差异表达基因,其中254个上调,1 060个下调。主要受影响的分子功能是转录、转录调节和电子转移链。改变最显著的信号通路是阿尔茨海默病、帕金森病和氧化磷酸化。结论 FFI改变了丘脑大量基因表达,其中受影响最显著的信号通路与其他神经退行性疾病相关。

ADAM10处理增强铜离子诱导的重组朊蛋白的蛋白酶抗性

目的 分析ADAM10对铜离子诱导后的PrP蛋白的剪切特点.方法 常规方法表达、纯化人PrP全长蛋白（aa 23-230）,利用氯化铜对纯化后的PrP蛋白进行诱导.用不同浓度的ADAM10对PrP蛋白进行处理,检测诱导后全长蛋白及剪切片段的PK抗性.结果 重组人PrP蛋白经Cu2诱导后具有部分抵抗PK消化的特点.Cu2＋诱导后的PrP蛋白可被ADAM10剪切,具有剂量依赖性.ADAM10对Cu2＋诱导的PrP蛋白处理后抵抗PK消化的能力明显加强.结论 ADAM10可以剪切Cu2＋诱导的PrP蛋白,同时增加了处理后PrP蛋白的PK抗性.

羊瘙痒因子263K感染仓鼠脑组织中兰尼碱受体2表达变化的研究

目的探索RyR2在朊病毒感染金黄仓鼠脑组织中的表达变化。方法通过免疫组织化学染色观察到RyR2在正常仓鼠及263K毒株感染仓鼠的脑区分布情况；通过免疫印迹方法观察到正常及263K毒株感染仓鼠终末期脑组织中RyR2表达变化情况；通过免疫荧光双标染色检测RyR2是否与朊蛋白存在共定位关系。结果RyR2主要分布在仓鼠的小脑浦肯野细胞、大脑皮层，而在海马、下丘脑和嗅球也有表达。263K毒株感染仓鼠终末期脑组织中，RyR2表达显著下降；免疫荧光双标染色发现，RyR2与朊蛋白存在共定位关系。结论RyR2的表达在朊病毒感染的金黄仓鼠中变化明显，可能与认知功能的下降及神经元调亡有关。此研究为进一步探讨RyR2在朊病毒病中的作用和分子机制提供了一定基础。

Prion蛋白SOD活性研究进展

PrPC的生理功能至今仍未完全清楚,但目前认为PrPC在神经信号传导、参与铜代谢、抗氧化活性、细胞黏附和识别、脂类摄取以及形成记忆中起着重要的作用,其抗氧化功能主要表现为SOD样活性,并且在体内参与了抗氧化应激功能。目前从动物实验、细胞水平、分子水平均证明PrPC具有SOD活性,其SOD活性是铜依赖性的且与构象有密切的联系,其八肽重复区、疏水区以及C端的GPI锚都对其SOD活性有不同程度的影响,特别是其八肽重复区的影响最为明显。PrPC与SOD活性可能为今后对于正常prion蛋白的了解和朊病毒病的致病机制以及预防和治疗这类疾病带来新的方法。