2003年～2005年北京地区甲3型流感病毒流行株金刚烷胺耐药性调查

目的:为我国制订流感大流行防备计划提供参考。方法:对2003年～2005年北京地区流感样患儿分离的流感病毒流行株30株,用RT-PCR一步法扩增流感病毒M2基因片段、测定核酸序列和进行生物信息软件分析,确定耐药性氨基酸位点。结果:M2基因31位氨基酸被天冬酰胺置换的有20株,显示对金刚烷胺类药耐药率为66.7%。结论:应在我国进一步开展抗流感病毒耐药性监测。

检测流感病毒的多重RT-PCR一步法及其应用

目的 为快速筛查和确诊流感提供快速检测手段，本研究拟建立一种检测流感病毒的RT-PCR一步快速法。方法 在一个反应管中流感病毒的反转录和扩增2个病毒基因的片段同时进行。结果 该方法较普通RT-PCR法以及巢式RT-PCR法操作简便、更快捷，与其它呼吸道病毒无交叉反应；敏感性至少可检出10^3病毒颗粒。结论 本方法对流感快速确诊的准确性更高，具有实际的应用价值。

2004年中国甲3亚型流感病毒(H3N2)抗原性及基因特性研究

目的阐明2004年中国流行的甲3亚型流感病毒血凝素抗原性及其基因变异情况。方法对2004年分离的甲3亚型毒株先进行单向血凝抑制试验及交叉血凝抑制试验;在此基础上选取不同时间、地点的甲3亚型流感毒株进行血凝素基因HA1区核苷酸序列测定并推导出其氨基酸序列,然后进行基因进化特性分析。结果单向血凝抑制实验结果表明,2004年共有52.3%毒株与A/Fujian/411/2002(H3N2)(20042005毒株)有4倍或以上的血凝抑制滴度差异,交叉血凝抑制实验结果表明,它们间的抗原比为4。HA1区核苷酸序列和氨基酸序列分析表明,我国从2004年2月分离的甲3亚型毒株开始出现了与A/Fujian/411/2002(H3N2)和A/Wellington/1/2004(H3N2)(2005年国际代表株)相比较,在其HA1蛋白分子上存在有4个氨基酸位点(159位Y>F,189位S>N,145位K>N,226位V>I)发生了替换。此类毒株首发于我国南方,然后到我国北方。结论我国2004年2月份以后所分离的甲3亚型流感毒株已经发生抗原性及基因特性的改变。

云南省2004年流感流行情况分析

目的了解2004年云南省流感流行情况及病毒的变异情况。方法定期采集流感样病人标本以及从暴发疫情中采集标本,利用MDCK细胞从标本中分离病毒,对分离病毒利用血清学方法进行抗原性分析;对病毒的HA1基因进行序列测定,用DNAstat软件进行基因种系发生树分析病毒的遗传变异情况。结果2004年云南省共分离到甲3亚型流感病毒50株,乙型流感病毒56株,没有分离到甲1亚型流感病毒。62%的甲3亚型流感病毒与A/福建/411/2002(H3N2)的血凝效价有4倍或以上差别;2004年4月份以后分离的甲3亚型流感病毒HA1区氨基酸序列上与A/福建/411/2002(H3N2)相比第145位K>N,159位Y>F,189位S>N,226位V>I发生氨基酸替换。5.8%的Yamagata系毒株与B/上海/361/2002血凝效价有4倍或以上的差别,HA1区氨基酸序列与B/上海/361/2002比较,第36、40、129、131、179、232、255位发生了氨基酸替换。10.8%的Victoria系毒株与B/浙江/2/2002有4倍或以上的差别。与B/浙江/2/2001比较第121,126,197位发生了替换。结论2004年云南省流行甲3亚型流感毒株和乙型流感毒株,并且它们的抗原性和基因特性发生了变异。

猪型(H1N1)流感病毒血凝素和神经氨酸酶基因来源的研究

目的研究2002年我国内地从猪群中分离的猪型(H1N1)毒株HA和NA基因来源,及其使猪致病的原因。方法用PCR扩增目的基因,用PGEM-T Easy Vector,4℃过夜连接,重组质粒转入DH-10B细菌,筛选阳性菌落,酶切鉴定,送六合通公司自动测序,并作进化树分析。结果 3株猪型(H1N1)病毒的HA和NA基因属猪型(H1N1)流感病毒,而不同于其他禽或人的H1N1亚型流感病毒。2002年猪型毒株由1991年猪型毒株演变而来。近来我国内地猪群中猪型毒株活动增强,其对猪能致病是由于病毒粒HA和NA蛋白抗原性发生变异所造成。结论3株猪型病毒的HA和NA基因来源于猪型(H1N1)毒株。近来猪型毒株对猪具有致病性和活动增强是由于其HA和NA蛋白分子上氨基酸序列发生替换所造成。

2004-2008年我国流行的A型流感病毒抗原性及HA1基因特性的研究

目的了解我国2004-2008年A（H1N1、H3N2）型流感病毒流行情况、抗原性和基因特性变异关系，了解疫苗株与我国流行株之间抗原性变化情况。方法选择2004年以来我国分离的A（H1N1、H3N2）型流感病毒进行抗原性及HA1区基因序列，通过比对HA1蛋白位点变异情况，分析我国流感病毒抗原性及基因特性变化情况。结果A（H1N1）亚型流感毒株抗原性2004-2007年分离的A（H1N1）亚型流感病毒的抗原性与疫苗株A／New Caledonia／20／1999（H1N1）类似；2008年我国流行的A（H1N1）亚型毒株的抗原性与2008-2009年北半球的流感疫苗株A／Brisben／59／2007（H1N1）类似。2004-2005年分离的A（H3N2）亚型流感病毒的抗原性与疫苗株A／Fujian／411／12002（H3N2）比较发生了变异；2006-2007年我国流行的H3N2毒株与A／Wiscansin／67／2006（H3N2）类似，2008年我国流行的H3N2毒株与疫苗株A／Brisben／10／2006（H3N2）类似。结论2004-2008年我国流行的A（H1N1、H3N2）亚型流感病毒的抗原性和基因特性发生了改变。

2004年冬季北京患儿中低滴度甲3型流感病毒HA1基因特性分析

目的分析2004年流感流行季节北京地区流感样病患儿患者分离的低滴度甲3型流感病毒血凝素(HA1)基因的特性。方法用2004年流感流行季节分离的22株低滴度甲3型流感病毒提取病毒RNA,经RT-PCR扩增得到HA1区基因片段。用生物信息软件分析HA1区基因特性。结果扩增的血凝素HA1区基因均为987bp。22株HA1氨基酸序列与当年的疫苗参考株比较,发现氨基酸变异,变异位点在3个抗原决定簇(A、B、D)和受体结合部位的位点,提示本流行季节的流感病毒变异较大,与世界卫生组织推荐2005年疫苗参考株比较,与南半球参考株有2个抗原决定簇(A、D)的氨基酸存在不同,与北半球参考株无明显差异。还发现1株变异,在高保守受体结合部位的底部98位氨基酸也发生了变异。结论2004年冬季流感流行株的变异倾向值得密切关注。

Peramivir体外抗禽流感H7N9病毒有效性研究

目的 研究Peramivir体外抗禽流感H7N9病毒效果 方法 采用体外抗病毒实验方法和流感病毒神经氨酸酶抑制实验并结合病毒序列分析的方法 结果 体外抗病毒实验发现三个抗病毒药物peramivir,oseltamivir和zanamivir针对禽流感病毒A/Anhui/1/2013（H7N9）的抗病毒有效浓度EC50分别是0.74±0.24 μmol/L,25.5±16.0μmol/L,29.4±6.2μmol/L,但是针对A/Shanghai/1/2013（H7N9）的有效浓度分别是74.4±18.7 μmol/L,＞1000 μmol/L,和37.1±11.9 μmol/L,各自有100倍,大于40倍和1.2倍的升高.体外神经氨酸酶抑制实验发现三种药物对两个实验病毒均是敏感的.序列分析发现A/Shanghai/1/2013（H7N9）神经氨酸酶基因有R292K的突变,这种突变公认是oseltamivir耐药的表现.结论 在MDCK细胞上三种抗流感病毒药物均表现出对病毒A/Anhui/1/2013（H7N9）的有效性.但针对A/Shanghai/1/2013（H7 N9）病毒peramivir,oseltamivir有一定的抗性.判断一个病毒是否是耐药毒株需要结合神经氨酸酶抑制实验、序列分析和药物的抗病毒实验结果来综合分析.

H9N2禽流感病毒反向遗传系统的构建和鉴定

目的建立H9N2亚型禽流感病毒反向遗传系统，为人禽流感疫苗研制以及传播和致病机制等方面的研究提供技术平台。方法使用RT-PCR方法获得禽流感H9N2亚型病毒A，Guangzhou／333／99（H9N2）的8条全长基因节段，然后克隆到双表达载体pCI-pol I中，获得H9N2禽流感病毒的8个基因节段的8质粒系统。将构建好的8质粒共转染293T细胞后，收获上清接种鸡胚，然后对鸡胚尿囊液进行鉴定；对拯救的病毒进行鉴定。结果8质粒系统转染293T细胞后可以成功拯救出H9N2禽流感病毒，血凝效价可达到2^9／50μl，生长特性与野生型病毒类似。结论成功建立了H9N2禽流感病毒反向遗传系统。

H5N1禽流感病毒NS1蛋白与干扰素诱导蛋白1O表达的相关性研究

目的 研究高致病性禽流感（HPAI）H5N1病毒NS1蛋白对干扰素诱导蛋白10（IP-10）的影响。方法 分别将禽流感病毒A／Anhui／1／2005（H5N1）的NS1基因、插入80～84位缺失氨基酸的NS1突变基因及流感病毒A／Puerto Rico／8／1934（H1N1）的NS1基因克隆至真核表达载体pEGFP-N1．转染人支气管上皮细胞BEAS-2B，流式细胞仪检测转染细胞内IP-10的表达情况。结果 与pEGFP-N1对照组相比，三种NS1蛋白均能下调BEAS-2B细胞IP-10的表达（P〈0．01），但三者之间下调程度差异无统计学意义（P〉0．01）。结论 A／Anhui／112005（H5N1）禽流感病毒单-NS1蛋白能够抑制BEAS-2B细胞IP-10表达，但这并不能完全阐明其与病毒致病性之间的关系。

中国2000～2001年流行性感冒流行概况

目的 了解中国 2 0 0 0～ 2 0 0 1年流行性感冒 (流感 )流行及抗原性变异情况。方法 鸡胚传代病毒用于抗原性分析 ;病毒液提取RNA进行逆转录 聚合酶链反应 (RT PCR) ,扩增产物纯化后测序。然后用MegAlign(Version1.0 3 )和Editseq(Version3 .69)软件进行基因种系发生树分析。结果 2 0 0 1年流行的H1N1亚型病毒血凝素蛋白重链 (HA1)区氨基酸序列与A 上海 7 99(H1N1)相比 ,在抗原决定簇D区的第 190位发生了氨基酸替换 ;基因种系发生树表明 2 0 0 1年的H1N1亚型流感病毒存在基因特性不同的两系病毒株。国内人群中仍然同时流行着两种抗原性明显不同的B型流感病毒 (Yamagata系和Victoria系 ) ,Yamagata系病毒占大多数 ,Victoria系的HA1区基因与B 山东 7 97毒株相比 ,其 197和 199位氨基酸发生了替换。B型的基因种系发生树也证实Victoria系病毒株的抗原性改变。 2 0 0 0年分离的H3N2亚型流感病毒的HA1区氨基酸序列与A 悉尼 5 97(H3N2 )间有 7～ 8个氨基酸的差异 ;2 0 0 1年分离的H3N2病毒株与 2 0 0 0年的病毒株相比 ,又在 83、186、2 0 2、2 2 2位发生了氨基酸替换 ,表明H3N2亚型病毒株间的抗原性发生了较明显的变异。结论 2 0 0 0～ 2 0 0 1年中国流感的流行情况较为平静 ;H3N2亚型的抗原性发生?

中国2002～2003年度流行性感冒监测分析

目的 阐明 2 0 0 2年 4月至 2 0 0 3年 6月国内流行性感冒 (流感 )流行特点和流感病毒优势株的特性。方法 流感病毒分离采用鸡胚和细胞分离 ;流感病毒亚型鉴定采用血球凝集抑制试验 ;对流行株的HA基因核酸测序 ,分析其亲缘关系和抗原变异性。结果 2 0 0 2年 4月至 2 0 0 3年 6月 ,全国 2 3个省 (市 )和自治区共采集流感样患者咽拭子标本共计 1613 5份 ,经鉴定流感病毒阳性 1113株 ,分离率 6.9%。在 1113株流感病毒中 ,A1型 66株、A3型 544株、B型流感病毒Yamagada 98株和Victoria 40 5株 ,分别占总分离数的 5.9%、48.9%、8.8%和 3 6.4%。优势流行株为H 3N 2和B型Victoria株。A3型流感病毒除主要分离于 2 0 0 2年 12月和 2 0 0 3年 1月外 ,在非流行高峰期也有一定数量的分离。而B型Victoria系流感病毒主要集中分离于冬季流行高峰期 ,其流行株核酸序列分析属B型Victoria系株。A3型毒株血凝素基因的HA1系统树分析表明 ,其与A Panama 2 0 0 7 99同源 ,且有某些变异存在。结论 虽然感染人群的流感毒株依然是A1、A3和B型交叉出现 ,但以A型(H3N2 )和B型Victoria为优势株。与历年不同 ,B型Victoria分离比例增加及分布广泛是 2 0 0 2～2 0 0 3年度的特点。A型 (H3N2 )流行株有变异迹象值得密切注意。

人禽流感酶联免疫诊断方法的建立及其初步应用

目的建立人禽流感H5抗体的酶联免疫检测方法（ELISA）。方法用ELISA法检测疑似高致病性禽流感患者及正常人群血清标本中H5IgG抗体。结果23例疑似高致病性禽流感患者血清样品中有4例H5IsG抗体阳性，阳性率为17．40％，与血凝抑制试验（HI）和微量中和试验（NI）相比较，三者符和率为100％。234例正常人群血清H5 IgG抗体检测均为阴性。结论建立的ELISA方法可用于高致病性人禽流感的血清样品初步筛查。

CVB3诱导的急性心肌炎C57BL/6小鼠模型转录组分析

研究柯萨奇病毒B3(CVB3)感染小鼠所引起的心肌组织转录组变化规律。C57BL/6小鼠腹腔接种浓度为104TCID50的CVB3,建立C57BL/6急性病毒性心肌炎小鼠模型,逐日测量体重。接种第3、6、9、11和14d分别取心脏,计算心脏指数,并取部分心肌组织进行HE染色分析病理学改变;病毒接种后的第3、第6和第9d,取部分组织匀浆进行转录组测序,分析三个时间点的共同差异表达基因,对其进行GO和KEGG信号通路的富集,并对其中12个基因进行了qRT-PCR的验证。在CVB3感染后,小鼠体重下降至对照组的80%,心脏指数在第3d明显升高,随后逐渐下降。通过转录组分析找到100个共同差异基因,从中选出的12个基因,经qRT-PCR验证与转录组表达趋势一致。GO和KEGG信号通路富集发现,CVB3感染后,小鼠心肌组织出现病毒性心肌炎、NK细胞通路,T、B细胞激活及先天性免疫反应通路的改变。差异基因的蛋白与蛋白互作网络分析显示,先天性免疫中MHC-Ⅰ型分子蛋白基因H2-Q7、H2-K1、H2-D1等,NK细胞毒作用通路中的Gzmb、Gzma,以及蛋白酶体信号通路基因Psmb8、Psmb9、Psmb10和lfit3位于相互作用中心。CVB3感染C57BL/6小鼠心肌组织的转录组变化涉及病毒性心肌炎、NK细胞和T、B细胞激活及先天性免疫反应等通路。CVB3感染引起的急性病毒性心肌炎是多通路和多基因综合作用的结果。