狂犬病早期临床表现与实验室诊断研究

目的对狂犬病的早期临床表现及实验室诊断进行分析,以提高临床早期诊断水平。方法对北京地坛医院2010年9月—2011年10月收治的经实验室检查确诊的9例狂犬病患者进行前瞻性研究,找出早期特异性表现,并对实验室特异性检测结果进行分析。结果所有患者在病程第1～2天均有低热、烦躁、完全失眠而不困倦等表现,这种状态可持续至病程的第3～4天。恐水、恐风、畏光等特征性症状多出现于病程的第3天及以后。所有患者外周血白细胞计数及中性粒细胞百分比明显升高,均值分别为(15.55±5.25)×109/L、(84.24±6.16)%。部分患者ALT、AST、BUN、CRE升高。所有患者CK明显升高,均值为(6931.9±1586.3)U/L。患者血液、脑脊液、唾液标本经反转录聚合酶链反应(reverse transcription-polymerase chain reaction,RT-PCR)检测,狂犬病病毒核酸为阳性者分别为2例(2/9)、2例(2/5)、4例(4/6)。8例(8/9)血液中的狂犬病病毒中和抗体滴度升高。结论低热、烦躁、完全失眠而不困倦等症状较恐水、恐风、畏光等出现更早,为狂犬病的早期特征。RT-PCR检测血液、脑脊液、唾液标本的狂犬病病毒核酸与快速免疫荧光灶抑制试验检测血清相结合,可作为狂犬病实验室诊断的有效方法。

我国部分地区病毒性脑炎标本的实验室检测

目的初步了解我国病毒性脑炎的病原种类及其分布特征。方法用ELISA方法对2004年至2006年从我国6个省份收集的771例临床诊断为病毒性脑炎患者的急性期血清和脑脊液标本检测乙脑病毒IgM抗体，然后对乙脑IgM抗体阴性的所有血清标本检测其他7种常见病毒IgM抗体。此外，用PCR方法对54例脑脊液标本检测肠道病毒、版纳病毒和辽宁病毒的基因。结果经血清学检测，771例患者中的567例（73．5％）检测出病毒特异性IgM抗体，构成顺序为乙脑病毒（47.0％）、腮腺炎病毒（10．6％）、肠道病毒（8．8％）、单纯疱疹病毒（5．7％）、麻疹病毒（O．4％）、水痘-带状疱疹病毒（0.4％）、EB病毒（0.4％）、巨细胞病毒（0．3％）；经分子生物学检测，在54例脑脊液中检测到8例（14．8％）肠道病毒基因阳性标本，未检测到版纳病毒与辽宁病毒基因阳性标本。结论乙脑病毒是我国病毒性脑炎的首要病原，腮腺炎病毒次之，肠道病毒和单纯疱疹病毒也是重要的病原。

流行性乙型脑炎病毒在自然界的保存与扩散及传播媒介

流行性乙型脑炎（简称乙脑）国际上称为日本脑炎（Japanese encephalitis），是由蚊虫等吸血昆虫叮咬感染乙脑病毒引发的急性传染病。病死率较高，而且后遗症严重，对人类健康危害较大。乙脑也是一种人兽共患的自然疫源性疾病。本病主要分布在亚洲和西太平洋地区^[1,2]，

从病毒性脑炎患者标本分离的基因I型乙脑病毒全基因组序列特征研究

目的通过现代分子生物学理论与技术测定和分析了从脑炎患者脑脊液标本分离的基因I型乙脑病毒（GZ56株）全基因组序列特征，以了解其致病性的分子基础。方法采用RT．PCR法和核酸序列测定法获得病毒基因组全序列，并利用DNASTAR、ClustalX version2．0．9及MEGAversion4．1等生物学软件分析该乙型脑炎病毒核苷酸序列、氨基酸序列及系统进化等。结果研究结果表明从病毒性脑炎患者脑脊液标本分离的基因I型乙脑病毒（GZ56株）基因组全长为10965nt，编码3432个氨基酸。病毒全基因组分子进化分析显示GZ56株全基因组与国际上第一株从蚊虫分离的基因I型乙脑病毒（M-28株）处于同一进化分支。GZ56株与其他基因I型乙脑病毒核昔酸和氨基酸序列同源性分别为96．2％～98．6％和98．2％～99．7％。病毒E基因与乙脑病毒灭活疫苗株P3相比存在11个氨基酸差异位点，而与乙脑病毒减毒活疫苗株SA14-14-2相比，在E蛋白上存在14个氨基酸差异位点。结论本研究提示，从病毒性脑炎患者标本分离的基因I型乙脑病毒全基因组未见明显变化，从基因组水平可以推测该病毒可以被现行的乙脑疫苗所保护。

控制狂犬病应从源头做起

全国狂犬病疫情近年持续上升，疫情波及范围不断扩大。2004年至2006年，全国报告狂犬病病例数分别为2651、2537和3279例，死亡人数共计8403例，占同期各种传染病病死数的30．1％，高居37种法定报告传染病病死数之首。与亚洲地区目前狂犬病仍然严重流行的其他国家不同的是，大多数狂犬病仍然严重流行的国家均为贫困落后地区，

控制犬狂犬病是消除我国人间狂犬病的关键

中国人间狂犬病自1996年以来一直持续上升，2007年报告3293个狂犬病死亡病例，为1996年狂犬病死亡病例数（159）的20．7倍。狂犬病的持续上升引起了国家有关部门的高度重视。为了尽快控制住狂犬病的流行，卫生部、农业部和中国疾控中心于2005-2009年先后发布了一系列预防控制狂犬病的指导性文件、规范和标准。

辽宁省部分地区2006年虫媒病毒分离鉴定

目的调查辽宁省虫媒病毒的种类及分布。方法2006年8月在辽宁省沈阳市、营口市、盘锦市、锦州市和丹东市采集蚊虫标本，利用组织细胞培养分离病毒，对病毒分离物进行血清学和分子生物学鉴定。结果5个市共采集蚊虫标本5410只，分离到8株阳性分离物，经鉴定其中3株（LN0684、LN0688、LN0689）为版纳病毒，1株（LN0636）为甲病毒属盖塔病毒，另外4株尚在鉴定。新分离的版纳病毒与我国此前的分离株处于同一个进化簇，核苷酸同源性91.2％-94.7％。新分离的盖塔病毒与韩国分离株（swine）在一个进化枝上，核苷酸同源性为99.2％，与俄罗斯分离株、中国大陆分离株及台湾分离株的核苷酸同源性在95％-99％之间。结论2006年在辽宁省分离到3株版纳病毒、1株盖塔病毒和4株未知虫媒病毒。版纳病毒、盖塔病毒为辽宁省首次分离；盖塔病毒核苷酸同源性和韩国分离株最近。

中国狂犬病N基因分子流行病学调查研究

目的通过分析近年中国狂犬病病毒流行株N基因特征和遗传变异状况，探讨我国狂犬病的流行分布与狂犬病病毒遗传变异间的关系。方法对不同流行地区、不同宿主动物来源的狂犬病标本，进行病毒N基因编码区下游720个核苷酸序列测定、序列同源性比较和种系发生分析。结果获得相应区段的狂犬病病毒核苷酸序列34份；核苷酸序列同源性87．5％～100％，推导的氨基酸序列同源性93．3％～99．6％，核苷酸序列的变异主要为同义突变。结论34个病毒标本都属于基因Ⅰ型狂犬病病毒且具有地域性特征。我国狂犬病高发病地区狂犬病病毒来源多样化，且病毒呈现从高发病地区向周边地区的传播和扩散，野生动物与家养动物之间，本国动物与外国动物之间，可能均存在着狂犬病病毒的交叉感染和相互传播。

云南省文山中越边境地区虫媒病毒调查

目的 对云南省文山县、河口县等中越边境地区开展虫媒病毒调查，以期了解当地蚊虫携带虫媒病毒情况。方法2007年9月在当地5个采集点共采集蚊虫8326只，包括库蚊6091只，中华按蚊1334只，刺扰伊蚊848只，阿蚊53只，并保存于液氮。经消毒、研磨、离心等处理后进行组织培养细胞接种，分离病毒和对病毒分离物进行血清学和分子生物学鉴定，以软件进行病毒的核苷酸序列比对和系统发生分析。结果从库蚊分离到4株对C6／36细胞致病变的病毒分离物，其他蚊种没有分离到病毒分离物。鉴定结果表明，标本WS0704-2与版纳病毒抗体反应，PCR鉴定为版纳病毒，该病毒基因组第12片段的进化关系同中国其他版纳病毒有明显差异，位于一条独立的进化枝中，在进化上相对独立。标本WS0704—1、WS0708—1、WS0708-2为浓核病毒。结论云南省文山中越边境地区存在多种蚊虫媒介并携带版纳病毒等虫媒病毒。

基于第12节段基因序列的版纳病毒分子遗传进化分析

目的 了解自1980-2012年在世界各地分离的版纳病毒分子遗传进化特征。方法 采用多种生物信息学分析方法，对1980-2012年我国及世界各地分离的版纳病毒进行基于第12节段基因序列的系统进化、分子溯源分析。结果 版纳病毒的共同进化祖先出现时间为315（95% HPD：63～619）年前，第12节段的进化速率为2.33×10-3（95% HPD：2.84×10-4～8.52×10-3）碱基替换/位点/年，提示版纳病毒属于新发快速进化的虫媒病毒。结论 版纳病毒属于快速进化的新发虫媒病毒，其地域分布范围进一步扩大且已经分化出新的病毒变种，应加强对该病毒在自然界分布及其致病性的监测。

冰冻切片染色法观察重组狂犬病病毒对乳鼠脑的感染和定位

目的冰冻切片染色法观察重组狂犬病病毒对乳鼠脑的感染和定位。方法将本实验室构建并拯救成功的人用狂犬病疫苗株重组病毒（CTN—GFP）脑内接种1日龄乳鼠和4周龄成年鼠，待感染乳鼠发病后至濒死期，通过心内灌流方法固定并制作脑组织冰冻切片，观察重组病毒在感染鼠的大脑海马组织中的绿色荧光蛋白的表达及分布。结果DAPI将所制作的冰冻切片中脑组织内细胞的胞核染成蓝色，在共聚焦显微镜下观察到受感染乳鼠的脑组织海马回位置有大量绿色荧光蛋白的表达。结论通过制作脑组织冰冻切片的方法可以清楚的观察到病毒的感染及其在海马回中的位置，同时为追踪病毒在体内的移行过程提供了一种新方法。

细胞适应株狂犬病病毒反向遗传系统辅助质粒的构建

目的构建细胞适应株狂犬病病毒反向遗传系统中所需的4个结构蛋白辅助质粒。方法利用RT-PCR方法扩增细胞适应株狂犬病毒的核蛋白（N）、磷酸化蛋白（P）、糖蛋白（G）、转录大蛋白（L）基因，测序结果正确后，分别连接表达载体，构建反向遗传所需的4个功能性蛋白辅助质粒。结果成功扩增4个结构基因，经测序完全正确，并成功构建反向遗传体系中N蛋白、P蛋白、G蛋白、L蛋白的辅助表达质粒，酶切鉴定完全正确。结论成功构建狂犬病病毒拯救系统的4个辅助质粒，为此细胞适应株狂犬病病毒的拯救奠定基础。

含有增强型绿色荧光蛋白报告基因的辛德毕斯病毒的制备与鉴定

目的 制备含有增强型绿色荧光蛋白（enhanced green fluorescent protein,EGFP）报告基因的辛德毕斯病毒,并对其进行鉴定.方法 采用融合PCR技术将报告基因EGFP融合到辛德毕斯病毒XJ-160感染性克隆pBR-XJ160的结构基因编码框后,并在报告基因前面添加亚基因启动子SP6,通过反向遗传学技术拯救得到EGFP标记的辛德毕斯病毒.结果 成功拯救并获得了EGFP标记的XJ-160病毒,该重组病毒具有良好的荧光表达特性和遗传稳定性.结论 EGFP标记的辛德毕斯病毒可用于观测病毒的侵染轨迹,为进一步研究辛德毕斯病毒嗜性、生物学功能,以及感染机制奠定了基础.

质粒型甲病毒复制子载体系统的构建及其功能鉴定

目的 构建质粒型甲病毒复制子载体系统,并对其功能进行鉴定.方法 在XJ-160病毒感染性cDNA克隆的基础上,将病毒非结构基因序列分为三个片段扩增,分步克隆至真核表达载体pVAX1 CMV启动子下游,并用多克隆位点序列替代病毒的结构基因构建XJ-160病毒质粒型复制子载体.将病毒核蛋白基因及包膜糖蛋白基因分别克隆至pVAX1 CMV启动子下游构建载体的两个辅助质粒.通过绿色荧光蛋白报告基因及海肾荧光素酶报告基因的表达检验该质粒型载体系统的功能特性.结果 成功构建了包括复制子载体和辅助质粒的质粒型甲病毒复制子载体系统,且该复制子载体系统可成功表达绿色荧光蛋白报告基因及海肾荧光素酶报告基因.结论 本研究构建了能够表达外源基因的质粒型甲病毒复制子载体系统,为目标基因表达、重组病毒颗粒制备等奠定了基础.

狂犬病高发地区犬只感染情况调查分析

目的 分析自然状况下犬只感染狂犬病毒状况及其与人间狂犬病的关系。方法 2005年10月到2006年12月间，在狂犬病疫情最严重的贵州、广西和湖南3省区的狂犬病高、中、低发病地区分别选择1～2个市作为标本采样点，用直接免疫荧光法和RT-PCR两种方法检测标本。结果 在3省区的15个市共收集犬脑标本2887份，检测阳性标本66份，感染率为2、3％，不同地区犬感染率与当地人狂犬病发病率不呈线性相关。结论 犬只感染狂犬病毒普遍存在，这是我国狂犬病高发区疫情严重的一个重要因素。

直接快速免疫组化法在我国狂犬病诊断中的初步应用

目的 评价诊断狂犬病的新方法一直接快速免疫组化法（Direct Rapid Immunohistochemical Test，DRIT）在我国狂犬病实验室监测工作中的应用推广价值。方法 采用美国疾病预防控制中心（CDC）狂犬病室新近建立的检测狂犬病毒抗原的DRIT法与目前常用狂犬病诊断方法直接荧光抗体法（Direct Fluorescent-antibody Assay，DFA）和反转录．聚合酶链式反应（Reverie Transcription Polymerase Chain Reaction，RT-PCR），检测来源于贵州、广西、湖南、安徽、江苏和云南6个省（区）的72份家犬及患者脑组织标本。通过比较3种方法的检测结果，评价DRIT法的敏感性和特异性。同时分析3种方法的实验成本、技术要求等指标，讨论DRIT法的优势所在及适用范围。结果 3种方法对所有标本的检测结果一致，DRIT法具有与DFA法和RT-PCR法同等的敏感性和特异性。与其他两种方法相比，DRIT法具有研究成本低、技术要求也较低的特点，更适于经费有限及技术力量较弱的实验室采用。结论 DRIT法在狂犬病诊断中有良好的应用价值，适于在我国基层CDC的狂犬病实验监测工作中普及推广。

第16届美洲狂犬病会议纪要

第16届美洲狂犬病会议于2005年10月17-21日在加拿大渥太华召开.该会议已经成为以美洲地区国家为主的从事狂犬病相关研究和预防控制专家的多学科国际研讨会.在法国赛诺菲-巴斯德公司赞助下,中国疾病预防控制中心也派代表参加了这次会议.会议的主题包括狂犬病的治疗和致病性研究、宿主动物生物学及动物狂犬病的控制、预防人狂犬病的经验以及狂犬病的诊断、监测和流行病学.