三个监测点医院2001—2004年婴幼儿轮状病毒腹泻监测

目的 了解3个监测点医院2001年8月至2004年7月住院的5岁以下婴幼儿轮状病毒腹泻流行状况。方法 以医院为基础的哨点监测,监测对象为5岁以下腹泻住院患儿。收集患儿的临床资料和粪便标本并进行轮状病毒检测和分型。结果 共检测3121份腹泻患儿的粪便标本,轮状病毒检出率为51%。94%的轮状病毒腹泻发生在2岁以下儿童。G3型为流行优势株,占69．9%,其次为G1型6．6%、G2型2．9%、G9型2．2%、G4型0．3%。P[8]型为最常见的P基因型。最常见的P-G组合型是P[8]G3,占64．0%,还有其他7种不常见的P-G组合的毒株类型。结论 轮状病毒是3个监测点医院住院腹泻患儿的主要病原,P[8]G3型为主要流行株。

福建省诺如病毒腹泻暴发的流行病学研究

对福建省三个地区出现的四起疑似诺如病毒腹泻暴发事件进行了流行病学调查，并对分离病毒进行核苷酸序列对比与分析。 1．材料与方法：从具有典型临床症状的腹泻患者中采集53份粪便标本。采用ELISA检测轮状病毒、诺如病毒、星状病毒和腺病毒抗原。粪便标本提取病毒核酸，取部分RNA进行反转录，扩增人类杯状病毒（HuCV）基因。

轮状病毒G血清型和P基因型与腹泻严重程度的关系

目的了解轮状病毒G血清型和P基因型与腹泻严重程度之间的关系。方法收集2001年8月至2003年7月4个监测点医院5岁以下住院腹泻儿童的粪便标本和临床信息，对标本进行轮状病毒检测和分型，根据Vesikari 20点评分法对轮状病毒腹泻患儿的严重程度进行评分。结果当与P[8]基因型结合时，P[8]G1型和P[8]G3型患儿的严重程度评分分别为13分和12分，腹泻天数分别为6d和5d，G1型患儿中发热的比例高于G3型（97％与73％），而且发热患儿的最高体温G1型也高于G3型（39℃和38．6℃）。当与G3血清型结合时，P[4]G3和P[8]G3型腹泻严重程度评分无统计学差异，但P[4]型比P[8]型的腹泻天数长（分别为6．5d和5d），而P[8]型呕吐的最高次数比P[4]型多（分别为4次和3次）。结论当与P[8]型结合时，G1型腹泻比G3型腹泻严重。当与G3型结合时，P[4]和P[8]型腹泻严重程度评分无差异。

我国广东、福建地区2000～2001年手足口病肠道病毒71型分离株的种系进化分析

目的 采用逆转录聚合酶链反应 (RT PCR)检测我国广东、福建地区 2 0 0 0～ 2 0 0 1年手足口病 (HFMD)散发病例中的肠道病毒 71型 (EV71) ,进而通过扩增VP1节段的核苷酸序列 ,进行毒株的种系进化分析。方法 以肠道病毒特异引物对EV 1、EV 2进行RT PCR ,经琼脂糖凝胶电泳鉴定为阳性的标本 ,进一步用EV71特异引物对 15 9S、16 2A进行RT PCR ,扩增的VP1节段经纯化后与测序载体pGEM T连接 ,转化大肠埃希菌DH5α ,筛选后测序。所得序列与我国深圳、上海、武汉地区的EV71流行株 ,中国台湾 1998年 4例HFMD暴发分离的EV71毒株 ,及来自美国、日本、匈牙利等国家地区的EV71毒株的核苷酸序列 ,用ClustalX 1 8和PHYLIP 3 5进行比对分析 ,构建种系进化树。结果 2 5份标本检测EV71的阳性率为 2 0 % ,所得序列经种系进化分析 ,与肠道病毒 71型的其他毒株同源 ,与深圳 1998年HFMD散发分离的EV71毒株同源性为 94 % ,与上海 2 0 0 0年HFMD暴发分离株同源性为94 %～ 96 % ,与武汉 1987年HFMD病例中分离的毒株同源性为 91% ,而与国外EV71毒株同源性仅为82 %～ 84 %。结论 EV71是我国南方地区HFMD的主要病原之一 ;我国大陆地区的EV71毒株在种系进化上有较高的同源性 ;与我国台湾地区大部分分离株亦有 90 %～ 91%的核苷酸?

2013—2014年长沙急性下呼吸道感染住院儿童腺病毒的分子流行特征

目的了解2013．2014年长沙地区急性下呼吸道感染患儿人腺病毒（HAdV）的基因型别和流行特征，为腺病毒的防治提供依据。方法搜集2013年4月至2014年3月湖南师范大学附属第一医院儿童医学中心因急性下呼吸道感染住院的患儿的鼻咽抽吸物（NPAs）603份，用荧光定量PCR方法进行11种常见呼吸道病毒的核酸检测。采用巢氏PCR扩增腺病毒阳性标本的hexon基因片段并进行序列分析。结果603例标本共检测出HAdV阳性标本119份，检出率为19．73％。成功分型88份，其中7型27例，占30．68％；2型17例，占19．32％；3型14例，占15．91％；1型14例，占15．91％；5型6例，占6．82％；6型3例，占3．41％；4型4例，占4．55％；57型2例，占2．27％；14型1个，占1．14％。人腺病毒感染呈全年散发，夏季检出率相对较高。感染人群主要是7岁以下儿童（95．80％）。结论人腺病毒是2013—2014年度长沙地区儿童急性下呼吸道感染的重要病原体，优势流行株为7型和2型。B亚组中HAdV-7、HAdV-3的致病性强于c亚组及E组中的其他型别。

7型腺病毒疫苗株序列测定及其六邻体特性分析

目的 完成7型腺病毒疫苗株(Ad7v)的全序列测定并阐明其六邻体特征。方法 克隆Ad7v基因组17.5-68.0 mu片段,应用Sanger双脱氧法进行DNA序列测定,将编码六邻体蛋白的核苷酸序列输入GenBank数据库中,获得录入号为AF515814。用CLUSTAL.V软件比较Ad7v与其他亚组及同一亚组腺病毒的六邻体蛋白的同源性,分析其抗原性的差异,同时用RasMo12.71软件预测Ad7v六邻体三维结构。结果Ad7v 17.5-68.0 mu由17 596个碱基组成。这段基因r链主要编码晚期基因L1、L2和L3,L链编码E2的一部分。六邻体编码多肽位于L3区,由934个氨基酸残基组成,与其他9个已知的六邻体蛋白序列进行多序列同源性比较,发现Ad7疫苗株与其他亚组腺病毒的同源性为86.8％(Ad4)-78.5％(Ad5)。在同一亚组中,Ad7疫苗株与Ad3同源性最高,高达95.1％。可变序列主要集中在7个高变区(HVRs),根据Ad2六邻体三维结构模型预测Ad7六邻体三维结构,发现可变区大部分位于六邻体顶端的Ⅰ1和Ⅰ2环中。结论 完成了Ad7v的全序列分析,其六邻体序列与Ad5、Ad2等其他亚组病毒有很大差异,这一结果为构建新型腺病毒载体打下了基础。

婴幼儿肠道腺病毒研究进展

婴幼儿腹泻病是世界范围内影响儿童健康的常见病和多发病。病毒性腹泻是导致全球儿童急性重症腹泻的重要原因，此病也是发展中国家小儿死亡的主要疾病。肠道腺病毒（enteric adenovirus，EAdv）是20世纪80年代发现的一种新的导致婴幼儿腹泻的主要病原。近年来的研究表明EAdv在免疫缺陷患儿中可增加发病率和延长住院时间，国内外有暴发或流行的报道。许多国家已将EAdv的检测列入腹泻病的常规检查。但我国目前对EAdv的基础、临床及流行病学的研究还比较缺乏。近年来，随着临床检测技术的提高，对其研究不断深人，危害性日益受到临床医生的重视。50年代初，Rowe等在切除的儿童腺体细胞培养物的自发性退行性病变中，首次发现腺病毒；1975年Flewett等首次应用电镜技术，从急性胃肠炎患儿粪便中发现与婴幼儿胃肠炎直接相关的腺病毒。这些在电镜下观察到的大多数腺病毒，均不能在常规应用的腺病毒细胞培养系统中培养，这些腺病毒称之为肠道腺病毒。1981年Takiff等首次用Graham 293细胞分离成功，推动了对EAdv的研究。1995年程绪杰等首次在我国从腹泻患儿粪便中分离到EAdv。现将EAdv的生物学特性、流行病学特点及临床表现及其检测技术等方面的研究现状作简要综述。

人轮状病毒G2和G3型主要中和抗原VP7基因在重组腺病毒中的表达

目的 研究我国G2和G3型轮状病毒主要中和抗原VP7基因在重组腺病毒中的表达。方法 在前期成功表达G1型VP7的基础上 ,选用我国G2和G3型主要流行株 97S4 3和 97S4 8VP7基因 ,用非复制型腺病毒载体对上述基因进行表达。结果 获得了表达我国G2型和G3型人轮状病毒流行株VP7基因的非复制型重组腺病毒rvAdG2VP7和rvAdG3VP7,应用PCR及Southernblot技术证实在重组腺病毒中整合有轮状病毒G2型VP7和G3型VP7基因 ,RT PCR证明重组腺病毒在感染的 2 93细胞内均能有效地转录插入基因 ,Westernblot检测到轮状病毒VP7基因的表达。结论 这一工作为进一步进行动物实验 ,发展多价轮状病毒疫苗打下了基础。

诺如病毒河北卢龙株NHBGR59全基因组序列分析

目的 分析河北卢龙县腹泻儿童粪便标本中存在的诺如病毒株NHBGR59的全基因组序列，了解其基因结构特点和进化特征。方法根据454高通量测序获得的两个重叠群（contig）和诺如病毒参考株序列（GenBank登录号KM198534）设计NHBGR59特异性引物，用重叠反转录聚合酶链反应（ReversetranscriptionPCR，RT—PCR）和cDNA末端快速扩增的技术（rapid—amplificationofcDNAends，RACE）的方法扩增其全长基因，经过分子克隆、测序获得全基因组序列，然后进行三个开放阅读框（OpenReadingFrames，ORFs）序列和系统进化树的分析。结果诺如病毒河北卢龙珠HBGR59病毒全基因组全长为7563bp（除了PolyA尾），病毒基因组分为三个ORFs：ORF1（5～5098nt）、ORF2（5079—6731nt）和ORF3（6731～7510nt），其中ORFl和ORF2之间有20bp重叠，ORF2和ORF3之间有lbp重叠。经过全基因组序列分析发现其和基因组II基因型6（genogroupIIGenotypeVI，GII．6）诺如病毒株30443同源性最高（同源性为98．O％）。ORF2以及ORF3核苷酸和氨基酸序列与株30443同源性最高（分别为97．0％，98．0％；99．0％，98．0％）。ORFI的基因和氨基酸序列与台湾暴发的急性胃肠炎GII．6株11-FJ-5（GenBank号KM461694）同源性最高（99．0％，99．3％），只在高突变P2区发生一个氨基酸突变位点：aa308D—N；其中衣壳区的氨基酸序列与其他GII-6型诺如病毒相似度为73．0％～99．3％。进化树分析发现河北卢龙株HBGR59与GII．6型株30443和11-FJ-5亲缘关系最近。结论河北卢龙株HBGR59为诺如病毒GII．6型，进化关系上与已报道的GII.6型株30443和11-FJ-5最近。

一起不明原因感染性腹泻疫情的病原学诊断

目的明确一起不明原因感染性腹泻疫情的病原体及其基因型别。方法通过流行病学调查的方法，查明罹患率。对28例疑似病例的28份样本（粪便22份，呕吐物3份，肛拭子3份）采用RT-PCR方法进行诺如病毒核酸检测，并对5份阳性标本的核酸进行序列测定及遗传进化分析。结果在调查的5694人中，发病160例，罹患率为2．81％。2007年3月7-913为发病高峰。RT-PCR检测28份样本中，确定14份为阳性。对其中的5株毒株的核酸序列测定及序列遗传进化分析确定为GⅡ／4型诺如病毒，并与2006年诺如病毒流行株2006b同源性最高，为97．9％。结论本次感染性腹泻疫情由诺如病毒引起。

GIV诺如病毒荧光定量一步RT-PCR方法的建立

目的 建立灵敏、特异的GIV诺如病毒的荧光定量检测方法.方法 合成针对GIV诺如病毒的特异性引物以及Taqman探针,优化反应体系及条件,根据我国新发人GIV诺如病毒序列（GenBank序列号：KC894731）构建荧光定量检测的RNA标准品,对其灵敏度、特异性、重复性进行评估,以传统逆转录-聚合酶链反应（Reverse transcription-polymerase chain reaction,RT-PCR）的方法作为参考评价.结果 该方法检测的灵敏度可以达到1.0×102拷贝/μl,检测范围为102 ～ 108拷贝/μl;与GⅠ、GⅡ诺如病毒、肠道腺病毒、轮状病毒、星状病毒等无交叉反应;批内和批间重复性实验的循环阈值（Ct）变异系数（CV）分别小于1.31％和3.68％;在阳性粪便标本的对比检测中发现,该方法与普通RT-PCR相比具有灵敏度高、能够定量的优势.结论 本研究建立的检测GIV诺如病毒的荧光定量一步RT-PCR法,可应用于G1V诺如病毒的检测.

广西猕猴中发现GⅡ.17型诺如病毒及其全基因组序列分析

目的 了解广西省龙虎山猕猴粪便标本中的GⅡ.17型诺如病毒的流行情况、基因结构和进化特征.方法 2015年3月～8月收集400份野生猕猴粪便标本,利用建立好的HISEQ高通量测序技术在粪便标本中发现了GⅡ.17型诺如病毒,命名为GX213.采用反转录-聚合酶链反应（Reverse transcription-polymerase chain reaction,RT-PCR）技术对其进行了序列鉴定、全长扩增和检测研究,并对三个开放阅读框（Open reading frames,ORFs）进行了序列和遗传进化分析.结果 筛查结果显示阳性率为0.5％ （2/400）.诺如病毒GX213毒株基因组全长为7 565 bp（包括PloyA尾）,其基因组分为三个ORFs：ORF1（10～5112nt）、ORF2（5093 ～ 6715 nt）和ORF3（6715 ～ 7494nt）,其中ORF1与ORF2之间重叠20 bp,ORF2和ORF3之间重叠1 bp.GX213病毒株全基因组序列分析显示,其与引起2014年至2015年亚洲部分地区暴发的新型人GⅡ.17型诺如病毒变异株CUHK-NS-613（GenBank ID：KU561248）同源性最高（同源性最高为99.5％）.ORF1和ORF3区核苷酸和氨基酸序列都与CUHK-NS-613同源性最高（分别为99.5％,99.4％;99.5％,99.2％）.ORF2区分析序列发现其与CUHK-NS-491毒株（GenBank ID：KP698928）同源性最高,核苷酸和氨基酸同源性分别为99.4％和99.8％,仅P1.1区发现了一个氨基酸的突变aa245P→S.另外,RdRp核苷酸和VP1氨基酸序列进化树分析显示该病毒株与人GⅡ.17型诺如病毒CUHK-NS-613和CUHK-NS-491的进化关系最近,而与首次被发现的猴GⅡ.17型诺如病毒KM1509（GenBank ID：KX356908）次之.结论 本研究发现的GX213属于2014年至2015年在亚洲地区引起暴发的新型人GⅡ.17型诺如病毒变异株,提示GⅡ.17型诺如病毒为人猕猴共患病毒.

1株野生鼠诺如病毒的全基因组序列测定及分析

目的为确定1株通过高通量测序获得的GV型野生鼠诺如病毒（MNV）变异株的基因组序列特征。方法将在山东地区采集的210只鼠经解剖后收集的肠道内容物和肝脏进行核酸提取，质检合格后送于华大基因进行高通量测序，获得一株GV型野生鼠诺如病毒。设计特异性巢式引物利用RT-PCR方法扩增该病毒全基因组。利用DNAMAN，MEGA5．0软件进行序列比对及系统进化分析。结果获得的GV型野生MNV变异株全基因组长度7382bp，与从数据库中选取的30株参考毒株全基因组序列相似度为76．8％～78．1％，其中VP1中的高变区P2编码的氨基酸相似度仅为60．9％～78．1％，表明该株MNV具有较高的变异率。结论本研究分离出了一株野生鼠诺如病毒，丰富了国内MNV的基因库，其变异特征为了解国内MNV的分子遗传特征及进化来源提供了参考依据。