重庆市库蚊标本中宜昌病毒的分离鉴定

目的对2017年采集自重庆地区蚊虫标本携带的病毒进行分离鉴定。方法采用组织细胞培养法进行病毒分离,应用高通量测序技术获得病毒分离物的全基因组序列,采用系统发育法进行种类及分子特征分析。结果库蚊标本来源的病毒阳性分离物CQFD2017能引起白纹伊蚊细胞C6/36病变,但不能引起金黄地鼠肾细胞BHK-21、非洲绿猴肾细胞Vero病变。CQFD2017全基因组序列长度为20893 bp,包含6个开放阅读框。系统进化分析发现,该毒株位于Nidovirales病毒目Mesoniviridae病毒科的Yichang病毒所在的进化分支,与Yichang病毒(NC_040534)的核苷酸一致性为98.6%,ORF1a和ORF1b区氨基酸一致性分别为99.06%和99.15%,因此将该毒株命名为Yichang病毒CQFD2017株。结论2017年重庆市库蚊标本分离的CQFD2017株为Yichang病毒。

山西省武乡县1株白蛉携带病毒(SXWX1816-2)的分离与鉴定

目的调查山西省武乡县白蛉标本携带病毒的种类及其流行情况。方法2018年6月在山西省武乡县采集白蛉标本,使用实验室保存的金黄地鼠肾细胞(BHK-21细胞)和白纹伊蚊卵细胞(C6/36细胞)2种细胞系进行病毒分离,阳性分离物经病毒RNA提取、cDNA文库制备后,进行病毒基因扩增与核苷酸序列测定及系统进化分析。结果SXWX1816-2病毒分离株可引起哺乳动物细胞(BHK-21细胞)病变,但是对昆虫细胞(C6/36细胞)并不引起病变。病毒基因组核苷酸序列测定和分析结果显示该病毒M基因和S基因编码区核苷酸序列长度分别为4089和1611 nt;病毒M基因和S基因核苷酸/氨基酸序列同源性分析和分子遗传进化分析结果均表明SXWX1816-2分离株隶属于白纤病毒科白蛉病毒属,并与我国此前分离的武乡病毒(Wuxiang virus,WUXV)的同源性最高,病毒基因分子遗传进化关系最近。结论明确了我国白蛉分离病毒(SXWX1816-2)的分类地位,研究结果为我国吸血昆虫携带病毒,特别是白蛉携带和传播病毒的研究提供了重要的基础数据。

2018年甘肃省平凉市流行性乙型脑炎病毒的分子特征

为研究甘肃省2018年蚊虫携带流行性乙型脑炎病毒(简称乙脑病毒)的分子特征,2018年7月上旬在甘肃省平凉市4个县采集蚊虫标本,采用实时荧光定量RT-PCR方法开展乙脑病毒筛查;通过高通量测序方法对乙脑病毒基因扩增阳性蚊虫标本进行深度测序研究。结果显示,本次调查在4个县共采集蚊虫1800只,均为三带喙库蚊,分36批研磨和检测。定量RT-PCR结果显示10批(27.8%)蚊虫样本呈乙脑病毒基因扩增阳性。对10批样本进行高通量测序共获得59.7 M读序,其中5.3 M(8.9%)条读序能够比对到病毒基因组数据库上,经注释属于14科15属28种病毒。在其中7批样本中检出乙脑序列共1357条,基因组覆盖度为9.5%-83.1%。系统进化分析显示甘肃省2018年采集的三带喙库蚊中乙脑病毒为基因I型。

库蚊黄病毒的病毒滴度测定方法建立

目的建立我国分离库蚊黄病毒(Culex flavivirus,CxFV)毒株(SDDM06-11)的病毒滴度测定方法。方法在6孔细胞培养板中培养C6/36细胞,感染库蚊黄病毒,加入甲基纤维素培养4 d,结晶紫进行染色,通过统计空斑数量计算病毒的噬斑形成单位。结果使用甲基纤维素-结晶紫空斑方法观察,发现CxFV(SDDM06-11)毒株感染C6/36细胞后形成清晰的圆形噬斑,大小如针尖,成功测定CxFV(SDDM06-11株)滴度在106.85 pfu/ml。结论甲基纤维素-结晶紫空斑法可用于测定CxFV滴度。

塔希纳病毒的重组酶介导扩增快速检测方法

目的采用反转录重组酶介导核酸扩增(RT-RAA)方法建立塔希纳病毒(TAHV)检测方法。方法在TAHV S节段保守区设计引物和探针。用构建含检测目的基因片段的质粒和病毒细胞培养物对TAHV的RT-RAA检测方法的灵敏性进行评价,通过检测黄病毒属、甲病毒属、正布尼亚病毒属和东南亚十二节段病毒属共7种病毒验证方法的特异性。并选用2018年采集自宁夏回族自治区的30批次蚊虫样本来评价该检测方法。结果该方法对构建的质粒标准品的检测下线为100拷贝/反应,病毒培养物最低检出限为10空斑形成单位/反应,与其他7种虫媒病毒无交叉反应。在检测蚊虫样本时,该方法与实时定量PCR方法检测结果的一致性为100%。结论建立了快速、特异以及灵敏的TAHV的RT-RAA检测方法,并适用于标本中TAHV核酸的现场检测。

Koutango病毒TaqMan反转录聚合酶链式反应方法的建立

目的建立Koutango病毒(KOUTV)的实时荧光定量TaqMan反转录聚合酶链式反应(RT-PCR)检测方法。方法从GenBank中下载KOUTV基因序列,进行多序列比对分析,针对NS5基因中的高保守序列片段设计KOUTV的特异引物与探针,用4科9种病毒进行检测方法特异性验证,通过平行重复实验验证检测方法稳定性,利用体外转录的RNA标准品建立了KOUTV的NS5基因拷贝数的绝对定量分析模型。结果引物与探针工作特异性良好,同一样品重复检测循环阈值(Ct)的变异系数均小于1.5%,定量分析模型灵敏度达到1.0×10^2拷贝/反应。通过本研究建立的快速检测方法对新疆采集的112批,6328只蚊虫进行了测定,结果均为阴性。结论成功建立了KOUTV的高特异性、高敏感性的TaqMan RT-PCR检测方法,可应用于实验室和临床诊断。

我国西北地区蚊虫标本中广平病毒的检测

目的对我国西北地区蚊虫携带病毒开展调查,并快速发现重要的蚊媒病毒。方法通过形态学方法对采集蚊虫进行分类鉴定,深度测序和宏基因组分析方法分析蚊虫携带的病毒,结合Sanger测序法补全病毒基因组全序,应用系统进化分析方法分析病毒分子遗传特征。结果2019年7月采集自陕西省的中华按蚊标本和宁夏回族自治区的三带喙库蚊标本均检测到黄病毒属广平病毒。进化分析结果显示,这两株广平病毒序列与在中国辽宁省发现的广平病毒JM17156株具有较近亲缘关系,核酸序列同源性为99.8%。结论本研究首次在我国西北地区中华按蚊、三带喙库蚊标本中检测到广平病毒。

盖塔病毒TaqMan RT-qPCR检测方法的建立与评价

目的建立一种灵敏且特异的实时荧光定量RT-PCR方法,用于快速检测盖塔病毒(getah virus, GETV)。方法从GenBank数据库下载GETV基因序列,使用Clustal X完成序列比对,针对高保守区段设计特异性引物和探针;以GETV核酸为标准品建立标准曲线,分别对检测反应的灵敏度、特异性和稳定性进行评价。结果本方法能特异地检测GETV,与多种虫媒病毒无交叉反应;灵敏度为1.0×10 pfu/ml,批内和批间变异系数均小于1%。从湖南、河北、福建、重庆采集的196批蚊虫中检出1批GETV阳性。结论建立了灵敏度高,特异性强的TaqMan探针实时荧光定量RT-PCR方法用于GETV筛查。

黑龙江省桦南县2020年蜱媒病毒调查

目的调查黑龙江省佳木斯市桦南县蜱及蜱媒病毒种类。方法于2020年5月在桦南县采集蜱标本,并进行形态学鉴定。利用实时荧光定量PCR方法对采集的蜱标本进行蜱传脑炎病毒(TBEV)、发热伴血小板减少综合征病毒、鄂木斯克出血热病毒、兰加特病毒、波瓦森病毒、阿龙山病毒核酸检测,并使用高通量测序法获得阳性病毒基因组序列。结果共采获890只蜱,包括全沟硬蜱475只(雄蜱210只、雌蜱265只),森林革蜱360只(雄蜱260只、雌蜱100只),嗜群血蜱55只(雄蜱5只、雌蜱50只)。1批(10只蜱混合)标本(JMS20)TBEV核酸阳性,由雌性全沟硬蜱携带。其他病毒核酸全部阴性。系统进化显示,该株蜱传脑炎病毒与远东型TBEV亲缘关系较近。结论佳木斯地区蜱媒样本仍携带蜱传脑炎病毒,研究结果为该地区蜱传病毒病的防控提供了基础数据。

2019年陕西省三带喙库蚊中淡色库蚊浓核病毒的分离与鉴定

目的本研究对2019年陕西省三带喙库蚊标本中分离的病毒(SX1943)进行病毒学和分子生物学鉴定。方法蚊虫研磨液接种组织培养细胞,对分离物进行病毒学和病毒分子遗传学分析。结果在2019年于陕西省采集的三带喙库蚊标本中获得1株病毒分离物(SX1943),将该病毒接种至C6/36细胞后第3天发生明显细胞病变,表现为细胞圆缩、聚集和脱落等,分离物可稳定传代。然而,该批标本在BHK-21细胞连续传代3次均未发现显著细胞病变。SX1943病毒接种至C6/36细胞后经电子显微镜(负染)观察,可见大量圆形病毒颗粒,直径约25 nm。SX1943病毒基因组扩增与测序结果显示,该病毒基因组序列全长为3594 nt,共编码3种蛋白,分别为非结构蛋白(NS1和NS2)和衣壳蛋白(VP),3种蛋白的基因长度分别为2376 nt、1098 nt和1136 nt。经病毒分子遗传进化分析发现,SX1943病毒与浓核病毒亚科Brevidensovirus病毒属中的淡色库蚊浓核病毒(Culex pipiens pallens Densovirus,CppDNV)处于同一进化分支,上述结果提示SX1943病毒为CppDNV。结论陕西省三带喙库蚊中分离到CppDNV。

2011和2019年甘肃省库蚊黄病毒分子遗传进化特征

目的揭示2011年和2019年甘肃蚊虫中库蚊黄病毒的分子遗传差异。方法使用逆转录聚合酶链反应(reverse transcriptase-polymerase chain reaction,RT-PCR)获得甘肃2011年和2019年蚊虫中库蚊黄病毒基因组核苷酸序列,利用病毒分子生物学和生物信息学方法分析病毒基因差异。结果共获得10株库蚊黄病毒基因核苷酸序列,包括2011年8株(均来自于淡色库蚊)、2019年2株(来自三带喙库蚊和中华按蚊)。病毒E基因核苷酸与氨基酸序列同源性分析结果显示,甘肃2019年分离的病毒与2011年分离病毒核苷酸序列相似性98.4%~100%,氨基酸相似性95.4%~97.3%。库蚊黄病毒E基因序列系统进化分析结果显示,2019年甘肃分离的2株库蚊黄病毒(GS1975和GS1976)与2011年的8株库蚊黄病毒均属于基因1型B组库蚊黄病毒;2019年分离的GS1975病毒与我国辽宁(2010年和2011年)和内蒙(2018年)分离病毒处在共同的进化簇,而2019年分离的GS1976病毒与我国内蒙(2018年)和甘肃2011年分离病毒形成共同进化簇。结论甘肃2011年和2019年分离的库蚊黄病毒均属于基因1型病毒,2019年分离的2株病毒分布在不同的进化簇,随着时间的推移当地库蚊黄病毒基因组在发生变化,为此需要开展当地库蚊黄病毒分子差异的长期监测。

宁夏首次分离到库蚊黄病毒及其分子遗传进化

为了解宁夏回族自治区(宁夏)虫媒病毒分布及其病毒分子遗传进化分析,本研究对宁夏采集的蚊虫研磨上清进行组织培养细胞分离病毒,并对病毒分离物进行病毒基因的分子生物学和分子遗传学分析等。结果显示在宁夏2019年采集的蚊虫分离到19批病毒基因扩增阳性的病毒分离物,其中3批在C6/36细胞出现明显细胞病变。病毒基因组序列测定结果显示以上19批均为库蚊黄病毒。病毒E基因序列分子遗传进化分析表明,本次宁夏蚊虫分离的库蚊黄病毒与我国北方地区的陕西省(2010年),辽宁省(2010年和2011年)和内蒙古自治区自治区(2018年)分离的库蚊黄病毒同为库蚊黄病毒基因1型B亚型(G1B)。本研究首次在我国宁夏地区蚊虫中分离到库蚊黄病毒,而宁夏地区的病毒株与我国北方地区分离的病毒株同为库蚊黄病毒新的基因亚型(G1B)。

黑龙江省桦南县蜱中松岭病毒的检测

目的对2023年采集自黑龙江省佳木斯市桦南县的蜱标本进行松岭病毒筛查。方法采用形态学方法对蜱标本进行分类鉴定,反转录实时荧光定量聚合酶链式反应(RT-qPCR)方法对采集的蜱标本进行松岭病毒(Songling virus,SGLV)筛查,并通过Sanger测序法获得阳性病毒基因序列信息。结果共采集421只蜱标本,包括森林革蜱184只(43.71%),全沟硬蜱115只(27.32%),日本血蜱32只(7.60%),嗜群血蜱43只(10.21%),长角血蜱7只(1.66%)及未鉴定若蜱40只(9.50%),其中1只雌性嗜群血蜱(编号:2023JMS365)经RT-qPCR检测为SGLV核酸阳性。系统进化分析显示,2023JMS365基因组L、M和S节段与SGLV参考株HLJ1202株的核苷酸一致性分别为96.78%、92.11%和97.59%,氨基酸一致性分别为99.22%、97.50%和93.28%。结论首次在黑龙江省佳木斯市桦南县的嗜群血蜱中检测到松岭病毒。

鼻咽和口咽导管介导IHFJV下肺癌患者PLVB诊疗中血气及快速反应基因对比研究

目的探讨鼻咽导管和口咽导管介导间歇性高频喷射通气(intermittent high frequency jet ventilation, IHFJV)下无痛电子支气管镜(painless video bronchoscopes, PLVB)诊疗过程中, 患者血气指标及快速反应基因表达的差异, 为肺癌患者PLVB诊疗的通气方式提供指导。方法选择接受PLVB诊疗的肺癌患者180例, 按随机数字表法分为鼻咽导管介导IHFJV组(对照组)和口咽导管介导IHFJV组(试验组), 每组90例。完善麻醉后, 两组患者分别给予鼻咽导管和口咽导管介导IHFJV供氧, 并实施PLVB。分别于术前20 min (T_(1))、手术开始5 min (T_(2))和术后5 min (T_(3))采集两组患者血液样本, 行血气分析, 记录pH值、总二氧化碳(total carbon dioxide, TCO_(2))、PaO_(2)、PaCO_(2)、肺泡-动脉氧分压差(alveolar-arterial oxygen difference, A-aDO2 )、碳酸氢根(bicarbonate radical, HCO3-)和碱剩余(base excess, BE)等指标, 并应用实时荧光定量PCR (real-time fluorescent quantitative PCR, RT-qPCR)法检测两组患者各时点血液中与缺氧应激有关快速反应样基因超敏C反应蛋白(hypersensitive C-reactive protein, hs-CRP) mRNA及缺氧诱导因子-1α (hypoxia inducible factor-1α, HIF-1α)mRNA的相对含量。结果与对照组比较, 试验组T_(3)时PaO_(2)升高、A-aDO_(2)降低(P<0.05);与T_(1)时比较, 两组患者T2时PaO2升高、A-aDO_(2)降低(P<0.05)。与T1时比较, 两组患者T_(2)、T_(3)时血液中hs-CRP mRNA、HIF-1α mRNA相对含量降低(P<0.05 )。其他指标差异无统计学意义(P>0.05)。结论肺癌患者接受PLVB诊疗时, 鼻咽导管和口咽导管介导IHFJV均能提供良好的通气效果, 但口咽导管可能更佳。

导读

虫媒病毒是指以吸血昆虫为媒介、在昆虫体内复制并通过其吸血过程而传染动物宿主或人的病毒。人类和家畜被吸血昆虫叮咬而感染虫媒病毒,可引起发热、出血热或脑炎等症状。虫媒病毒病属于人畜共患传染病。主要媒介为蚊和蜱,鸟类、蝙蝠、灵长类和家畜是虫媒病毒重要的动物宿主。