腺病毒伴随病毒表达载体表达人乳头状瘤病毒16型E6/E7基因的构建及应用

目的 为了了解人乳头状瘤病毒 (Humanpapillomavirus ,HPV) 1 6型的E6 /E7基因在细胞恶性转化中所起的作用 ,利用腺病毒伴随病毒载体 (AAVHelper -FreeSystem)构建和表达人乳头状瘤病毒 1 6型E6 /E7基因。方法 在pLXSN1 6E6E7质粒中经PCR扩增回收HPV 1 6E6E7基因片段 ,连接于T载体上进行测序 ,将正确的HPV 1 6E6E7插入pAAV -IRES -hrGFP质粒 ,协同pAAV -RC质粒和pHelper质粒共转染HEK 2 93细胞 ,包装表达HPV 1 6E6E7基因的重组腺病毒伴随病毒 ,收获病毒 ,并检测病毒的感染效率。结果 在包装细胞系HEK 2 93细胞中能形成较高感染效率的腺病毒伴随病毒 ,激光共聚焦检测可发现HEK 2 93细胞内有绿色荧光蛋白表达 ,HEK 2 93细胞经PCR可扩增出特异性的HPV 1 6E6E7基因片段 ,经流式细胞仪检测重组病毒的感染效率为71 3%。结论 携带人乳头状瘤病毒 1 6型E6E7基因的腺病毒伴随病毒可感染细胞 ,并在细胞内表达 。

人乳头状瘤病毒16型E6、E7基因诱导的人子宫颈永生化上皮细胞系的建立及其生物学特性的鉴定

目的 建立人宫颈上皮的永生化细胞系 ,并进行生物学特性进行鉴定。方法 用含人乳头状瘤病毒 (HPV) 16型E6、E7基因的腺病毒伴随病毒感染人胎儿宫颈上皮细胞 ,培养、传代。采用激光共聚焦免疫荧光和PCR技术检测HPV16型E6、E7基因的表达情况 ;取 2 0代细胞 ,采用软琼脂培养、染色体核型分析和Scid小鼠皮下接种等方法检测细胞系的生物学特性 ;采用电子显微镜观察细胞的形态。结果 2 0代细胞的表型仍保留原代上皮细胞的特征 ,表现为单层生长和锚锭依赖性生长。激光共聚焦免疫荧光和PCR技术检测显示 ,细胞内有HPV16型E6、E7基因的表达 ,其基因片断长度为 82 9bp。 2 0代细胞进行软琼脂培养不形成克隆 ;scid小鼠皮下接种未成瘤 ;染色体核型分析为二倍体和多倍体 ,11号染色体可能为HPV16型E6、E7基因整合的部位。电子显微镜观察可见张力原纤维 ,证实细胞为鳞状上皮来源。结论 成功建立了HPV16型E6、E7基因诱导的宫颈上皮永生化细胞系 ,且其生物学特性稳定 ,可进一步用以宫颈癌病因和发病相关机制的研究。