SD大鼠放射性肺纤维化模型的建立及评价

目的建立SD大鼠放射性肺纤维化模型,探寻实验中纤维化蛋白、细胞因子等作为组织纤维化程度评价指标的可行性,为放射性肺纤维化的研究提供基础。方法选取体重为180~200 g的SD雄性大鼠37只,完全随机分为对照组(5只)和照射组(32只)。照射组采用X射线行右肺单次照射,照射剂量分别为13 Gy(10只)、15 Gy(10只)和17 Gy(12只),分别于照后4个月和6个月,采用苏木精-伊红染色和马松三色染色评价大鼠肺组织纤维化程度;采用Western blot检测纤维黏连蛋白1(FN1)、基质金属蛋白酶2(MMP2)、α-平滑肌肌动蛋白(α-SMA)在肺组织中的表达;测定肺组织中羟脯氨酸含量以评价肺组织中胶原蛋白表达水平。酶联免疫吸附测定法测定支气管肺泡灌洗液中转化生长因子β(TGF-β)、白细胞介素6、肿瘤坏死因子α(TNF-α)、γ干扰素(IFN-γ)的变化。组间比较采用独立样本t检验。结果与对照组相比,照射组4~6个月后均出现肺纤维化,纤维化程度随照射剂量的增大和照射时间的增长而增加;照射组大鼠肺组织中FN1、α-SMA的蛋白表达水平较对照组升高,MMP2的蛋白表达水平较对照组降低;6个月照射组羟脯氨酸含量较对照组升高,分别从(514.19±282.20)μg/mg增加至(886.13±145.01)、(1188.70±273.84)、(1700.70±590.95)μg/mg,且差异均有统计学意义(t=2.621、3.609、4.004,均P<0.05);支气管肺泡灌洗液中TGF-β、白细胞介素6、TNF-α分泌量较对照组上调,差异有统计学意义(t=4.030~12.780,均P<0.05),IFN-γ较对照组下调,差异有统计学意义(t=2.498~4.303,均P<0.05)。结论SD大鼠放射性肺纤维化模型构建成功。大鼠肺组织纤维蛋白含量未能反映肺组织纤维化程度,肺组织羟脯氨酸含量与支气管肺泡灌洗液中细胞因子在重度纤维化时可作为评价指标。

CRIM1对非小细胞肺癌辐射敏感性和转移的影响

目的探讨富含半胱氨酸型运动神经元蛋白1(CRIM1)对非小细胞肺癌(NSCLC)辐射敏感性和转移的影响及可能的机制。方法采用短发夹RNA(shRNA)敲降NSCLC H460、H358细胞中CRIM1的表达,并将H460、H358细胞分别分为3组:H460细胞、H460-shCRIM1细胞、H460-shNC细胞和H358细胞、H358-shCRIM1细胞、H358-shNC细胞,其中shCRIM1表示用shRNA敲降CRIM1的表达,shNC表示阴性对照。采用小干扰RNA(siRNA)敲降H358细胞中CRIM1的表达,并将细胞分为2组:H358-siNC细胞和H358-siCRIM1细胞。采用细胞克隆形成实验(照射剂量为0、1、2、4 Gy)、慧星实验(照射剂量为8 Gy)和细胞免疫荧光实验(照射剂量为6、8、12 Gy)观察CRIM1对H460细胞辐射敏感性的影响。采用Transwell实验、细胞黏附实验观察CRIM1对H460、H358细胞转移的影响。构建小鼠H460原位肿瘤模型,采用组织病理学检查评估裸鼠肺内原位接种肿瘤转移情况。采用转录组学分析法探讨CRIM1影响NSCLC细胞转移的可能机制。组间比较采用两独立样本t检验。结果克隆形成实验结果显示,与H460-shNC细胞相比,1、2 Gy照射后H460-shCRIM1细胞的克隆形成率明显降低[1 Gy:(87.04±8.04)%对(58.01±4.39)%;2 Gy:(48.23±1.22)%对(31.43±0.08)%],且差异均有统计学意义(t=4.48、19.50,均P<0.05)。慧星实验结果显示,8 Gy照射后H460-shCRIM1细胞的olive尾距长于H460-shNC细胞,且差异有统计学意义(1.27±0.54对1.05±0.42,t=2.14,P<0.05)。细胞免疫荧光实验结果显示,H460-shCRIM1细胞受照后磷酸化组蛋白H2AX foci数多于H460-shNC细胞(6 Gy:14.33±2.81对11.00±3.92;8 Gy:34.00±11.14对21.17±6.15;12 Gy:25.80±3.96对20.17±3.31),且差异均有统计学意义(t=2.45、5.52、2.47,均P<0.05)。Transwell实验结果显示,H460-shCRIM1、H358-shCRIM1细胞的迁移率分别较H460-shNC、H358-shNC细胞明显升高,且差异均有统计学意义(t=4.73、10.19,均P<0.05)。细胞黏附实验结果显示,H460-shCRIM1、H358-shCRIM1细胞的黏附能力分别较H460-shNC、H358-shNC细胞下降,且差异均有统计学意义(t=2.86、3.66,均P<0.05)。组织病理学检查结果显示,原位接种H460-shCRIM1细胞的裸鼠肺内转移灶明显多于H460-shNC细胞。转录组学分析结果显示,筛选出的细胞黏附相关基因连接黏附分子2(JAM2)、连接蛋白3(NECTIN3)和紧密连接蛋白4(CLDN4)在H460-shCRIM1、H358-siCRIM1细胞中的表达均下降;并在体外实验中得到验证,其中,H460-shCRIM1细胞相较于H460-shNC细胞分别下降了86.66%、49.35%、30.27%(t=47.52、7.47、18.98,均P<0.05),H358-siCRIM1细胞相较于H358-siNC细胞分别下降了36.60%、31.70%、50.00%(t=7.40、7.10、16.56,均P<0.05)。结论抑制CRIM1可增强NSCLC细胞H460的辐射敏感性,CRIM1可能通过影响肿瘤细胞连接的方式影响NSCLC的转移。