牙龈卟啉单胞菌PrtC蛋白体外表达、纯化及功能初探

目的牙龈卟啉单胞菌PrtC蛋白体外表达纯化及功能初探。方法全基因合成牙龈卟啉单胞菌(P.gingivalis)ATCC33277中prtC基因,构建重组表达载体p29-prtC,生物信息学分析和低温诱导表达、SDS-PAGE、Western blot鉴定,酶解法检测胶原酶的功能。结果成功构建了PrtC蛋白原核表达载体,在大肠杆菌表达体系内获得可溶蛋白表达,通过亲和层析和分子筛层析纯化出高纯度且较稳定的PrtC蛋白,并且实验证明它具有降解胶原蛋白的能力。结论体外生化实验说明PrtC蛋白具有胶原蛋白酶活性,并且为后续解析PrtC蛋白的结构奠定了基础。

牙龈卟啉单胞菌蛋白酶Ltp1的表达、纯化及酶学性质研究

采用重组法构建Ltp1的原核表达载体,并将其转化至E.coli BL21(DE3)中进行异丙基-β-D-硫代半乳糖苷(IPTG)诱导过表达,然后用镍柱层析法粗纯化,分子筛细纯化得到目的蛋白,以SDS-PAGE电泳和Western blot分析表达产物;将目的蛋白和底物对硝基苯磷酸二钠显色反应分析其活性。SDS-PAGE结果显示有与目的蛋白理论相对分子质量一致的表达条带;Western blot分析证实该蛋白带有6个组氨酸(His)标签的目的蛋白,能够催化磷酸单酯的活性;计算出米氏常数(Km)和最大反应速率(Vmax)分别为70.4μmol、51.1μmol/(L·min),pH 5.0~6.0催化活性最高,在37~50℃具有较高活性。