植物次生代谢的分子生物学及基因工程

植物次生代谢是植物对环境的一种适应，是植物主要的防御机制之一。植物次生代谢物为人类提供了丰富的药物、香料等资源。近年来植物次生代谢途径关键酶的基因克隆和分子调控的研究成为热点。黄酮类生物合成分子生物学的研究最为深入。在异戊二烯途径中，萜类合成酶已从４种植物中克隆，包括单萜、倍半萜和二萜合成酶。这些将对农业与医药产生重要影响。

芸苔属植物CAL基因的结构特征与花球的形态遗传

从花椰菜变种 (BrassicaoleraceaL .var.botrytis)中分离出 4种花球类型的纯合株系 :光滑型花球curd_s、毛状物花球curd_h、颗粒状花球curd_c和刺状物花球curd_t。用PCR方法分别扩增各株系的BobCAL基因并分析其中的部分序列 ,发现 4种株系的CAL基因在第五个外显子中都有AAG向TAG的终止突变 ,而且该终止密码子上游 6 38bp的DNA序列完全一致 ,说明花蕾、茎生叶等花球附生物的形态发生不是BobCAL的单一调节作用。花椰菜与结球甘蓝 (B .oleraceavar.capitata)和青花菜 (B .oleraceavar.italica)杂交后其F1代植株都失去了原有花球的形态特征 ,表现出花序的多态性 ,从而显示了不同变种CAL相互作用的形态学差异。从大白菜中分离出CAL的同源基因 ,发现BcpCAL基因没有发生终止突变。分析了从大白菜 (B .campestrisL .ssp .pekinensis)中分离出的BcpCAL的基因结构特征以及与其他基因间的同源性。为了解CAL基因的生物学功能 ,研究花球形态发生的机制提供了分子和遗传证据。

植物细胞内外源基因的瞬间表达及其在基因表达调控研究中的应用

外源DNA通过物理或化学的方法导入植物原生质体后,在合适条件下,短时间内即可诱导所携带的基因表达。这种基因的瞬间表达受到导入外源基因的方法、DNA的状态及所构建的嵌合基因的结构、植物细胞本身的生理状态等因素的影响。目前这一瞬问表达系统已广泛应用于植物基因表达的调控研究。

生长素的极性运输及其在植物发育调控中的作用

生长素是已知的植物激素中唯一具有极性运输方式的激素。利用生长素极性运输抑制物和生长素极性运输突变体，使人们获得大量有关生长素及其极性运输在植物生长发育调控中具有重要作用的资料。与生长素极性运输有关的基因的克隆及其表达调控的研究将进而在分子水平上阐明其作用的机理。

一个双价锤头型核酶在体外对两种不同植物病毒RNA的专一切割作用

根据锤头核酶模型，设计合成了一个以黄瓜花叶病毒（ＣＭＶ） 外壳蛋白（ＣＰ） 亚基因组ＲＮＡ 为底物的锤头型核酶（ＲＺＣ） 。在证明它能有效切割该底物后，再将这个核酶与一个能专一性切割烟草花叶病毒（ＴＭＶ） 移动蛋白（ ＭＰ） 亚基因组ＲＮＡ 的锤头型核酶（ＲＺ１） 相互串联构成了一个双价核酶（ＲＺ１Ｃ） 。体外结果表明，这个双价核酶能与相应的单价核酶ＲＺ１ 和ＲＺＣ 一样专一而有效地切割ＣＭＶＣＰ和ＴＭＶ ＭＰＲＮＡ。

云南松成熟胚的体细胞胚胎的发生研究

云南松(Pinus yunnanesis Franch)是我国特产的一种优良森林树种,本研究采用云南松成熟合子胚为起始外植体,在含2,4-D 10mg/L,KT和BA各4mg/L的改良P6培养基上得到胚发生培养物。将白色半透明的胚性愈伤组织(含早期原胚)在含2,4-D1.0mg/L,KT和BA各0.4mg/L的培养基上保持并增殖。在附加9,000mg/L肌醇的高渗培养基(含NAA0.5mg/L,KT和BA各0.2mg/L)上得到粗壮的后期原胚。ABA和PEG同时使用能促进子叶胚的形成。在无激素培养基上,成熟体细胞胚萌发并进一步形成完整小植株。

生长素结合蛋白研究进展

生长素(auxin)是植物体内普遍存在的一类植物激素,它对植物的生长发育起着多方面的调节作用,如促进细胞伸长,诱导细胞分化,促进生根和单性果实(parthenocarpic fruit)的发育等,同时生长素还抑制芽的发生及果实的衰老。生长素作用机理的研究表明,生长素可以诱导一些特殊基因的快速表达,促进RNA和蛋白质的合成。因此,生长素可能是通过调节基因的表达来发挥作用。“酸生长理论”(acid growth theory)则认为,在细胞膜上存在着生长素的受体,生长素与之结合后激活了细胞质膜上的质子泵,破除了细胞壁纤维结构间的交织点,细胞壁的可塑性增加,从而使细胞伸长。尽管对“酸生长理论”一直存在争议,但植物体内存在生长素受体的证据在不断积累。70年代末。

生长素极性运输研究进展

Recent advances in dissecting polar auxin transport, i.e., the physiological characteristics and regulation of polar auxin transport, the chemiosmotic hypothesis for polar auxin transport, and the role of polar auxin transport in plant growth and development were reviewed. The authors here focus on the progress of new supports—isolation and function analysis of the genes encoding putative auxin carriers, for the old model of polar auxin transport.

根癌土壤杆菌介导转化诸葛菜子叶获得转基因植株

采用诸葛菜子叶为材料,在MS+BA3mg/L+NAA0.2mg/L培养基上诱导芽的再生,1/2MS+IBA0.03mg/L上诱导生根,获得完整再生植株,建立了诸葛菜组织培养高频再生系统,其再生率可达100％。采用土壤杆菌介导转化诸葛菜子叶,在附加一定量的氨苄青霉素、头孢霉素和卡那霉素的相应培养基上进行筛选,进而培养出再生成苗。获得完整植株,经GUS和NPTⅡ酶活测定,以及Southern blot分析,证实为转基因植株。转化子叶的芽再生率为51％,获得完整转基因植株的转化率为5.53％。在国内外首次建立了以根癌土壤杆菌(Agrobacterium tumefaciens)为载体,诸葛菜子叶为受体的遗传操作系统。

根癌农杆菌对甘蓝型油菜的转化及转基因植株的再生

用根癌农杆菌（Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｔｕｍ ｅｆａｃｉｅｎｓ）共培养法把外源基因导入甘蓝型油菜（Ｂｒａｓｓｉ－ｃａ ｎａｐｕｓＬ．）主要栽培品种“云北２ 号”，获得转基因植株。所用外植体为带有１—２ ｍ ｍ 子叶柄的完整子叶，根癌农杆菌为Ａ２０８ＳＥ（ｐＴｉＴ３７－ＳＥ， ｐＲＯＡ９３）。Ｔｉ质粒ｐＲＯＡ９３ 带有ＮＰＴⅡ及ＧＵＳ嵌合基因。共培养２ 天后转到附加２５ ｍ ｇ／Ｌ卡那霉素的分化培养基（ＭＳ＋ ４．５ ｍ ｇ／ＬＢＡＰ）上。ＡｇＮＯ３ 和羧苄青霉素促进芽的分化，头孢霉素则有抑制作用。最高转化频率为２７％ 。把分化出的茎芽切下，插入含有２５ ｍ ｇ／Ｌ卡那霉素的生根培养基中。羧苄青霉素不利于根的形成。把完整抗性植株移入盛土壤的盆中，生长状况良好。测定β－葡糖苷酸酶活性，８４％ 明显高于对照。以ＮＰＴⅡ基因作探针进行Ｓｏｕｔｈｅｒｎ ｂｌｏｔ分析。

棉花法呢基焦磷酸合酶cDNA克隆、序列分析及其在种子发育过程中的表达特征

根据法呢基焦磷酸合酶（ＦＰＳ）保守域设计简并引物，应用ＮｅｓｔＰＣＲ和ＰＣＲ９６孔板筛库技术分离到亚洲棉（ＧｏｓｙｐｉｕｍａｒｂｏｒｅｕｍＬ．）法呢基焦磷酸合成酶的ｃＤＮＡ。序列分析表明，该ｃＤＮＡ全长１２８０ｂｐ，开放阅读框共编码３４２个氨基酸残基，推断蛋白质分子量约为３９ｋＤ，推测的氨基酸顺序与拟南芥和青蒿的ＦＰＰ合酶序列同源性为７８９％和８０７％。应用ＲＴＰＣＲ定量分析ｆｐｓ１基因在“苏棉６号”（Ｇ．ｈｉｒｓｕｔｕｍＬ．ｃｖ．“Ｓｕｍｉａｎ６”）种子发育过程中的表达特征，发现从胚珠开始形成种子（开花后２０ｄ）至种子成熟（开花后４０ｄ），ｆｐｓ１ｍＲＮＡ转录水平发生明显变化。在种子发育早期，开花后２０ｄ至２７ｄｆｐｓ１基因保持相对稳定的表达水平；但从开花后２７ｄ到种子成熟，ｆｐｓ１ｍＲＮＡ的转录水平迅速增高，此期倍半萜棉毒素在种子中的积累亦呈明显的增长趋势，完全风干成熟的种子中倍半萜棉毒素的含量可达１３ｍｇ／ｇ。推测ｆｐｓ１基因在转录水平参与种子中倍半萜类物质合成的调控。

马尾松成熟合子胚的体细胞胚胎发生和植株再生

采用马尾松（Ｐｉｎｕｓｍ ａｓｓｏｎｉａｎａ Ｌａｍ ｂ．）成熟合子胚为起始外植体，在含２，４－Ｄ １０ ｍ ｇ／Ｌ，ＫＴ和ＢＡ 各４ ｍ ｇ／Ｌ的ＤＣＲ培养基上得到胚发生培养物。将白色半透明的愈伤组织（含早期原胚）在含２，４－Ｄ１．０ ｍ ｇ／Ｌ，ＫＴ和ＢＡ 各０．４ ｍ ｇ／Ｌ的ＤＣＲ培养基上保持并增殖。在附加９０００ ｍ ｇ／Ｌ肌醇的ＤＣＲ高渗培养基上得到粗壮的后期原胚。ＡＢＡ 和活性炭同时使用能促进子叶胚的形成，最高频率为３５．１％ 。在无激素培养基上。

根癌农杆菌介导转化诸葛菜获得转基因植株

以诸葛菜下胚轴和子叶为材料，在附加BA和NAA的MS培养基上诱导芽再生，在1／2MS培养基上诱导生根，获得完整再生植株，建立了诸葛菜组织培养高频再生体系，再用很癌农杆菌介导转化诸葛菜下胚轴和子叶，在附加一定量的氨苄青霉素、头孢霉素和卡那霉素的相应培养基上进行筛选，并培养再生成苗，获得完整抗性再生植株，移植到盛有土壤的花盆中均可存活，生长正常。将再生植株叶片，进行GUS、NPTⅡ酶活性测定和Southernblot分子杂交，证实外源基因已稳定整合到植物基因组中，并高效表达。

根癌土壤杆菌介导的水稻高效转化和转基因植株的高频再生

利用根癌土壤杆菌 (Agrobacteriumtumefaciens (SmithetTownsend)Conn)介导的转化方法对 4个粳稻 (OryzasativaL .ssp .japonica)品种和 2个籼稻 (O .sativassp .indica)品种进行了转化。在对影响根癌土壤杆菌转化水稻效率的多种因素进行比较研究后 ,建立了根癌土壤杆菌介导的水稻高效转化和再生系统。将水稻成熟胚和未成熟胚来源的愈伤组织用根癌土壤杆菌EHA10 1/pGIH感染后 ,筛选出抗性愈伤组织并获得转化植株。其中抗性愈伤组织产生频率最高达 5 5 .1% (籼稻 )和 85 .2 % (粳稻 ) ,转化植株产生频率最高达 37.8% (籼稻 )和 6 9.0 % (粳稻 )。GUS染色、转基因植株总DNA的PCR和Southern杂交检测等结果表明 ,T_DNA上的外源基因已整合进了转基因植物基因组中。对转基因T1代水稻植株的遗传分析结果证明外源基因能稳定遗传给后代 ,且大多数株系的分离比符合 3∶1。该转化系统的建立为将外源有用基因导入水稻并高效稳定地表达奠定了基础。

PEG法介导转化诸葛菜下胚轴原生质体获得转基因植株

采用诸葛菜无菌苗的下胚轴组织为材料，分离原生质体，在原生质体培养基中作液体浅层暗培养，植板率为５％，植株再生频率为１００％。作者进而开展了遗传转化研究。为研究ＰＥＧ介导转化诸葛菜原生质体的影响因素，通过瞬间表达，实验了ＰＥＧ法转化子叶原生质体的过程，在此基础上将分离纯化后的原生质体与带ＨＰＴ基因的质粒ＤＮＡ（ｐＢＩ２２２）混合，ＨＰＴ基因作选择标记，ＰＥＧ介导转化；重新收集转化后的原生质体，以５×１０４／ｍｌ的密度在原生质体培养基中作浅层培养；培养１０—１５天后用２５ｍｇ／Ｌ的潮霉素（ｈｙｇｒｏｍｙｃｉｎ）进行筛选，一月后出现少量细胞团，转入含潮霉素５０ｍｇ／Ｌ的扩增培养基扩增愈伤组织，进而转入含５０—１００ｍｇ／Ｌ潮霉素的分化培养基诱导分化成苗，分化率为１００％，转入生根培养基中生根成完整植株。抗性植株再生率为４×１０（－５）。在获得再生转基因植株后，以再生植株叶片为材料，进行Ｓｏｕｔｈｅｒｎｂｌｏｔ分子杂交，证实外源基因已稳定整合到植物基因组中并表达，再生转基因植株频率为１０（－５）。国内外首次转化诸葛菜属植物原生质体获得成功。

水稻淀粉分支酶基因5′上游区缺失对基因表达的影响

为研究水稻淀粉分支酶基因 (sbe1) 5′上游调控区中存在的顺式作用元件 ,我们将水稻sbe1基因翻译起始点 (ATG) 5′上游区 1.2kb(- 10 96～ +74bp)片段经过不同限制性内切酶消化及外切核酸酶ExoIII部分消化 ,得到 4个 5′端缺失的片段。将这些缺失片段分别与 gus基因编码区连接 ,构建成融合质粒 ,经土壤农杆菌 (Agrobacterium)介导引入水稻 ,定量测定转基因水稻植株未成熟种子中的 gus酶活力。结果表明 ,- 5 16～ +6 4bp的sbe1启动子片段可以驱动gus基因的高表达 ,其它 3个启动子片段 (- 10 96～ +74bp ,- 2 95～ +74bp ,- 146～ +6 4bp)驱动 gus基因表达的能力较低。推测在sbe1基因 5′上游区 - 5 16～ - 2 95bp片段中可能存在能使

用PEG法把外源基因导入甘蓝型油菜原生质体再生转基因植株

通过PEG处理把外源基因导入甘蓝型油菜原生质体。转化介质中二价阳离子的种类和浓度、携带DNA及PEG溶液的pH值都会影响基因导入效率。以潮霉素抗性和卡那霉素抗性作标记,均成功地筛选到了抗性愈伤组织。相对转化频率分别为1.3%和0.2%。前者明显高于后者。把抗性愈伤组织转到分化培养基上,分化出芽。诱导生根后移栽到土壤中,生长状况良好。酶活性测定和Southern blotting分析表明外源基因已插入到植物细胞基因组中。该遗传转化系统存在的主要问题是抗性愈伤组织分化频率较低。本文对其原因作了初步分析。

通过PEG法转化甘蓝获得转基因植株

通过PEG法将外源基因导入甘蓝(Brassica oleracea L.)下胚轴原生质体。以潮霉素和卡那霉素进行筛选,均成功地得到了抗性愈伤组织。对于潮霉素抗性愈伤组织,其绝对和相对转化频率分别为4.1×10^(-4)和1％～3％,在分化培养基上,抗性愈伤组织能够分化出芽。诱导生根后进行移栽,生长状况良好。Southem blotting分析表明外源基因已插入到植物细胞基因组中。对影响转化的一些因素进行了探讨。

GUS 基因在大豆未成熟子叶原生质体中的表达

本研究利用大肠杆菌的 GUS 基因(β-葡糖苷酸酶基因,为报告基因,以改良的 PEG 转化方法),对大豆(Glycine max L.)未成熟子叶原生质体进行直接转化。在原生质体培养基 KP8中培养1—6天和14—30天后,利用 GUS 基因产物与底物 MUG 反应的荧光分析和与底物X-Gluc 反应的组织化学定位实验,分别检测到 GUS 基因在大豆未成熟子叶原生质体中的瞬间和稳定表达。同时,对影响 PEG 转化的渚多因素,如 PEG 的毒性、转化后的原生质体稳定性等进行了讨论。

IaaL基因的维管束特异表达导致烟草茎和根外植体分化能力的改变

我们利用水稻苯丙氨酸解氨酶启动子(AQ630)和吲哚乙酰胺赖氨酸酯合成酶基因(iaaL)构建了维管束特异表达的植物表达载体pBAL1并导入烟草基因组中。比较了对照植株、转基因植株的幼茎和根外植体在组织培养中分化能力的变化,结果表明转基因植株茎外植体的不定芽形成明显受到促进,而转化植株根外植体在不定根发生方面对外源IAA的敏感性下降。