专家讨论2020年中国的科学和技术发展研究——基因组工程

1972年，斯坦福大学Berg实验室成功地完成世界上第一个体外基因重组实验，启动了重组DNA技术研究发展，直接导致了生命科学研究领域革命性的变化和一种全新的生物技术学科及产业的建立——基因工程。基因工程的诞生使得外源基因在细菌、酵母和动植物体内进行表达，从而打破了物种的遗传界限．在实验室内可以用工程原理和技术对生物直接进行改造。

肾小球系膜细胞转化生长因子-β_1基因启动子中氧化低密度脂蛋白应答元件的研究

目的 :了解在氧化低密度脂蛋白 (Ox LDL)刺激下 ,转化生长因子 β1(TGF β1)基因启动子中顺式作用元件的应答情况。研究在大鼠肾系膜细胞中 ,Ox LDL对TGF β1基因启动子转录活性的影响作用。 方法 :用聚合酶链反应 (PCR)、酶切和亚克隆的方法 ,构建出 5个TGF β1启动子缺失体—虫荧光素酶 (luciferase)报告基因 ,利用其瞬时转染系膜细胞并检测luciferase相对活性。 结果 :在Ox LDL(10 0mg/L)刺激下 ,luciferase的活性 12h即出现 ,并于 36h达到平台期。对Ox LDL刺激的应答 ,TGF β1启动子 15 5 0到 845之间可能存在着增强子 , 6 2 9到 4 2 2之间则可能有抑制子。计算机软件分析表明 ,前者内有一转录激活蛋白 1(AP 1)精确识别位点。 结论 :在大鼠肾系膜细胞TGF β1基因启动子中 ,AP 1结合序列 (TGAGTCA)可能是应答Ox LDL的顺式作用元件。Ox LDL上调TGF β1的表达至少部分是通过AP 1蛋白来介导的 ,且Ox LDL可能通过蛋白激酶C(PKC)信号通路激活AP 1从而正调控TGF β1基因的转录过程。

广西眼镜蛇蛇毒神经生长因子在大肠杆菌中的表达

目的采用基因工程技术,在大肠杆菌(E.coli)中表达广西眼镜蛇(黑眼镜蛇)蛇毒神经生长因子(NGF)成熟蛋白并检测其生物活性。方法将天然广西眼镜蛇蛇毒的NGF蛋白基因克隆至融合表达载体pET-40b(+)中,以C端融合了6个组氨酸的形式在E.coli BL21(DE3)通过异丙基硫代半乳糖苷诱导表达NGF蛋白。超声破菌后,将上清液经Ni^(2+)-NTA柱纯化,收集并冻干NGF融合蛋白,用蛋白印迹法分析其NGF抗原活性,并通过促PC12细胞生长法观察其生物活性。结果经蛋白印迹分析可知在38 ku处的条带具有NGF抗原活性。加入天然蛇毒NGF,生长轴突的PC12细胞为(83±3)%,重组品为(21±3)%,表明经纯化的融合蛋白具有NGF生物活力,但活性弱于天然蛇毒NGF。结论在大肠杆菌中可以表达出有活性的蛇毒NGF蛋白。

侧柏籽核糖体失活蛋白的分离及作用机制研究

提出了从裸子植物侧柏中分离纯化核糖体失活蛋白的制备和检测方法.通过盐溶液抽提、硫酸铵分级沉淀、阴离子交换层析、阳离子交换层析等步骤制备了该蛋白.该蛋白的检测方法是把这种蛋白作用于大鼠 80S肝核糖体后, 不经过酸性苯胺处理,直接进行聚丙烯酰胺的尿素变性胶电泳.在电泳图上得到 400 bp左右的特征性核酸条带.分析结果表明,该蛋白为一种新的核糖酶型的核糖体失活蛋白,阐明了侧柏核糖体失活蛋白失活核糖体的分子机制.

广西眼镜蛇毒中Natrin蛋白的分离及纯化

目的:从广西眼镜蛇毒中分离出Natrin蛋白。方法:广西眼镜蛇毒经Sephadex G75凝胶、CM Sepharose CL-6B离子交换层析及FPLC mono-S柱层析分离纯化出Natrin蛋白。结果:从广西眼镜蛇蛇毒中分离纯化得到的Natrin蛋白,经SDS-PAGE电泳测定其分子量为25ku,质谱测定其分子量为24.937ku,测得其N端的序列为NVDFNSESTRRKKKQKEIVD,C端的序列为NIKK。结论:从广西眼镜蛇毒中分离出纯的Natrin蛋白组分。

日本血吸虫保护性单克隆抗体SSj14识别模拟表位的筛选及其免疫原性分析

为分析日本血吸虫保护性单抗SSj14的模拟表位,观察其免疫保护作用,利用SSj14单抗筛选富集噬菌体的随机六肽库,应用免疫印迹法确定阳性克隆并分析其核苷酸序列,采用竞争ELISA法分析阳性克隆的抗原性,用筛选的阳性噬菌体克隆免疫小鼠进行日本血吸虫病免疫保护试验,计算减虫效果,并用ELISA法检测小鼠免疫前后的特异性抗体水平。结果显示,经3轮富集筛选后,免疫印迹法鉴定到4个阳性克隆,它们对SSj14单抗的抑制率分别为20.0%、40.8%、58.6%、61.5%,并分别在小鼠中诱导了7.42%、9.43%、11.74%、22.30%的减虫率。用噬菌体克隆免疫的小鼠均产生了较高水平的特异性抗体。结果表明,筛选到的阳性噬菌体克隆和SSj14单抗有较高的亲和力,并诱导了抗小鼠日本血吸虫的部分保护效果。

广西眼镜蛇毒中Natrin的克隆及在E.coli中的表达

目的采用基因工程技术,在大肠杆菌中表达广西眼镜蛇毒中Natrin成熟蛋白。方法将来源于广西眼镜蛇毒的Natrin蛋白的基因克隆至融合表达载体pMAL-c2x中,以N端融合了麦芽糖结合蛋白的形式在大肠杆菌BL21(DE3)通过异丙基硫代半乳糖苷诱导表达Natrin蛋白。超声破菌后,将上清液经Amylose树脂柱上纯化后,收集并冻干Natrin融合蛋白,利用蛋白印迹分析其是否有Natrin抗原活性。结果经蛋白印迹分析可知在50 kD处的条带具有Natrin抗原活性。结论在大肠杆菌中可以表达出Natrin蛋白。

广西眼镜蛇神经生长因子的克隆及序列分析

目的:扩增广西眼镜蛇神经生长因子(NGF)的全长基因并进行序列分析。方法:应用聚合酶链反应技术,以广西眼镜蛇cDNA为模板,扩增出编码NGF的全长基因,并克隆至pMD18-T载体中进行基因测序。结果:所得序列与Genbank提供的序列(M61180)对比显示,广西眼镜蛇prepro-NGF与Naja kaouthia(monocled cobra)、Bungarus multicinctus、mouse、人的NGF同源性分别为99%、91%、66%、68%,将不同氨基酸相同的化学性质计算在内,同源性更高。结论:成功地获得了广西眼镜蛇NGF的全长基因,且序列与已知序列高度一致。

癌症靶向治疗的新趋势

靶向性是癌症治疗的关键所在,新的治疗方案必须在特异性作用于肿瘤的同时降低对正常细胞的损伤,目前已取得了许多成果:1)肿瘤的靶向基因-病毒治疗结合了基因治疗和病毒治疗的各自优势。所用的病毒载体具有特异性靶向肿瘤的作用并在肿瘤细胞中大量复制和高效表达抗癌基因,如果用2个特异性启动子严格控制病毒只在肿瘤中表达,并加上2个有协同效应的抗癌基因即可达到极好的抗癌效果。2)在抗体治疗方面,运用第1代腺病毒高效表达Her-ceptin或是Rituxan抗体基因已取得成功,它可以大大地降低目前昂贵的抗体治疗费用。3)RNA干扰技术可以沉默致病基因,选用质粒或是病毒做载体可以达到长期及高效的基因沉默效果。4)具有自我更新能力的肿瘤干细胞是肿瘤复发的关键。5)人们也逐渐意识到肿瘤的形成过程是癌细胞与基质细胞相互作用的结果,以肿瘤基质为靶标的药物也显示出了良好的效果。6)针对蛋白酪氨酸激酶或是抗凋亡蛋白而研制的小分子靶向药物也在肿瘤分子治疗上取得了成功。7)纳米技术正以其独特性而引起广泛关注。总之,在众多新型治疗方案研发的同时,我们必须认识到仅仅靠一种方法是难以成功根治肿瘤的,各种靶向治疗方案之间的相互结合将成为肿瘤治疗的主攻方向。

地塞米松对体外循环诱发犬心、肺、脾及外周血单核细胞TLR-4 mRNA表达的影响

目的探讨地塞米松对体外循环(CPB)诱发犬心、肺、脾及外周血单核细胞(PBMC)Toll样受体-4(TLR-4)mRNA表达的影响。方法健康家犬10只,体重18～24kg,雌雄不拘,随机分为对照(C)组和地塞米松(D)组,每组5只。麻醉诱导前即刻D组静脉注射地塞米松1 mg／kg,C组给予等量生理盐水,麻醉诱导后建立CPB,测定CPB前、CPB 1 h、CPB 2 h、停CPB后30 min、停CPB后2 h时心、肺、脾、PBMC中TLR-4、TNF-α、热休克蛋白(HSP-70)mRNA表达及血浆一氧化氮(NO)、丙二醛(MDA)浓度。结果CPB可诱发心、肺、脾及PBMC中TLR-4、HSP-70、TNF-αmRNA表达及血浆NO、MDA浓度增加;地塞米松预先给药可减弱CPB诱发的上述改变(脾除外)(P<0．05)。结论地塞米松预先给药可减弱CPB诱发犬的全身炎性反应,与下调TLR-4 mRNA表达有关。

利用噬菌体随机9肽库筛选寻常型天疱疮抗原模拟表位

目的利用噬菌体随机9肽库筛选寻常型天疱疮抗原桥粒芯糖蛋白3（desmoglein，Dsg3）模拟表位，加深对寻常型天疱疮发病机制的认识。方法通过大肠杆菌表达Dsg3的胞外结构域1和2（extracellular domain，EC1-2）和谷胱甘肽转移酶（GST）的融合蛋白，从寻常型天疱疮患者血清中纯化与EC1-2特异结合的多克隆抗体，对噬菌体随机线九肽库和环九肽库进行亲和筛选，阳性噬菌体展示肽经ELISA和竞争性ELISA验证。结果经过两轮亲和筛选，与自身抗体结合的噬菌体明显富集，免疫筛查、验证后得到3个阳性噬菌体展示肽，ELISA检测显示它们与患者血清反应，而不与正常人血清反应，竞争性ELISA检测显示它们可以抑制寻常型天疱疮患者血清与重组蛋白EC1-2的结合。结论利用噬菌体随机9肽库筛选到3个与寻常性天疱疮密切相关的模拟表位。