Indian Hedgehog在牵张力促进成骨细胞增殖中的作用研究

目的观察Hedgehog(Hh)信号在牵张力调控成骨细胞增殖中的作用。方法体外分离和培养新生大鼠颅顶骨成骨细胞,应用Flexcell 4000TM加力系统施加3%和6%的2种牵张应变。用N端Hedgehog重组蛋白(N-Shh)、Hed-gehog通道抑制剂环巴胺(cy)和机械通道抑制剂三氯化钆(GdCl3)对成骨细胞进行干预。分别采用细胞计数、甲基噻唑基四唑(MTT)比色法和流式细胞仪检测成骨细胞的增殖。采用SAS 8.0软件包对结果进行统计分析。结果在成骨细胞体外培养过程中,牵张力促进了成骨细胞的增殖,以6%牵张应变更显著;牵张力仍能促进经cy处理后的成骨细胞的增殖,但这种促进作用能被GdCl3抑制。结论牵张力促进成骨细胞增殖的作用有一部分是通过上调Ihh的表达实现的。

牵张应力对Hedgehog通路相关基因和细胞增殖的影响研究

目的:观察牵张力下Hh通路相关基因的表达以及牵张力对成骨细胞增殖的影响,探索机械应力对成骨细胞的调控机制。方法:应用Flexcell 4000TM加力系统对大鼠成骨细胞施加0.5Hz,3%、6%和9%的张应变,作用时间4h、12h和24h。用机械通道抑制剂三氯化钆(GdCl3)对成骨细胞进行干预。采用流式细胞技术测定细胞周期分布与细胞增殖变化,定量PCR检测Hedgehog通路相关基因Ihh、Shh、Ptch和Smo的表达。采用SAS8.0软件包对结果进行统计分析。结果:不同强度、不同作用时间的张应变对Ihh表达量的上调作用亦不相同,6%张应变作用24h的对Ihh表达量上调最为明显,其下游基因Ptch和Smo的表达变化与Ihh类似;上述上调Ihh表达的作用均可被GdCl3抑制。;6%同3%牵张力相比,更能促进成骨细胞的增殖。结论:Ihh基因对力学刺激敏感;Ihh基因表达量的变化与成骨细胞的增殖相关。

Hedgehog通路对成骨细胞增殖和分化的作用

目的:研究Hedgehog通路因子Shh和Ihh对成骨细胞增殖和分化的影响。方法:体外分离和培养新生大鼠颅顶骨成骨细胞,RT-PCR检测Shh和Ihh信号的表达;用HedgehogN端重组蛋白(N-Shh)及Hedgehog通道抑制剂Cyclopamine(cy)对成骨细胞进行干预,分别采用MTT比色法、流式细胞仪、碱性磷酸酶(ALP)定性定量、茜素红染色检测成骨细胞的增殖、分化及基质钙化情况;实时定量PCR检测Hedgehog通路相关基因Ptch和Smo的表达。采用SAS8.0软件包对数据进行t检验。结果:在成骨细胞体外生长过程中,Shh的表达逐渐减弱,而Ihh的表达逐渐增强;N-Shh促进成骨细胞的增殖(P<0.05)和S期细胞比例增加(P<0.05),促进ALP的活性并促进Ptch和Smo表达(P<0.05);cy则抑制成骨细胞的增殖和分化(P<0.05)。结论:Hedgehog通路参与对成骨细胞增殖和分化的调节。

人IL-1受体拮抗蛋白重组逆转录病毒载体的构建、鉴定及在骨关节炎软骨细胞中的表达

目的构建含人IL-1受体拮抗蛋白(IL-1 receptor antagonist,IL-1Ra)逆转录病毒表达载体(PLXRN-IL-1Ra),体外转染人骨关节炎(osteoarthritis,OA)软骨细胞,研究其相关特性。方法利用细菌内同源重组技术快速构建PLXRN-IL-1Ra逆转录病毒重组质粒,经测序及酶切鉴定正确后转染PT67细胞,包装成为重组PLXRN-IL-1Ra逆转录病毒,并使用小鼠肾成纤维细胞系NIH/3T3对病毒进行滴度测定。实验分为3组:未转染组(A组)、PLXRN空质粒转染组(B组)、PLXRN-IL-1Ra转染组(C组),病毒感染人OA软骨细胞后,RT-PCR检测细胞内IL-1Ra基因的转录和表达;ELISA法检测细胞培养上清液中人IL-1Ra蛋白表达。结果酶切鉴定及基因测序证实重组逆转录病毒质粒中含有人IL-1Ra cDNA,测定包装的病毒滴度为3×104CFU/mL。原代软骨细胞体外培养呈多角形或梭形,甲苯胺蓝染色见细胞内有紫色异染颗粒。RT-PCR结果显示在C组出现311bp人IL-1Ra mRNA片段,A、B组未见人IL-1Ra mRNA的表达带,GAPDH在各组均有表达。ELISA检测发现C组细胞上清有一定量的人IL-1Ra表达,蛋白浓度为(60.47±15.13)ng/L,A组和B组均无人IL-1Ra表达。结论构建的IL-1Ra逆转录病毒表达载体成功地感染人OA软骨细胞,并在体外获得稳定表达,为将表达人IL-1Ra基因的人OA软骨细胞用于OA基因治疗提供了实验依据。

MSCs成骨分化中BMP2对成骨转录因子SATB2表达的调控作用

目的探索间充质干细胞(MSCs)成骨分化中骨形态发生蛋白2(BMP2)对成骨转录因子SATB2表达的调控作用。方法体外培养小鼠间充质细胞系C2C12,腺病毒介导的BMP2(Adv-BMP2)诱导其向成骨细胞分化,建立并验证C2C12细胞成骨分化细胞模型。Real-Time PCR和Western blotting分别检测C2C12细胞成骨分化过程中经不同浓度Adv-BMP2处理不同时间时SATB2 mRNA和SATB2蛋白表达;以经相应浓度Adv-β-Gal处理细胞作对照。结果经150 pfu/cell Adv-BMP2处理C2C12细胞5 d后,成骨细胞标志基因Ⅰ型胶原、骨唾液酸蛋白和骨钙素表达以及碱性磷酸酶活性均显著增加,MSCs成骨分化模型构建成功。150 pfu/cell Adv-BMP2诱导C2C12细胞成骨分化过程中,SATB2 mRNA和SATB蛋白表达随分化进程而增加;Adv-BMP2浓度为0～225 pfu/cell时,SATB2表达随Adv-BMP2浓度升高而增加。结论 BMP2可调控SATB2的表达,从而影响MSCs成骨分化。