响应面法优化超声波辅助提取米尔贝链霉菌中米尔贝霉素A3和A4的工艺研究（英文）

本文报道了超声波辅助提取米尔贝链霉菌中米尔贝霉素A3和A4的产量的方法,采用反向高效液相表征米尔贝霉素A3和A4的产量,并通过响应面法来优化提取工艺。对提取时间(X_1)、超声功率(X_2)和占空比(X_3)进行了三因素三水平BoxBehnken设计,以获得米尔贝霉素A3(Y_1)和A4(Y_2)的最佳产量。研究表明,最佳超声波辅助提取条件为:溶剂为乙酸乙酯,料液比0.8,提取时间30min,超声功率110W,占空比40%和提取温度10℃。在此提取条件下米尔贝霉素A3和A4的最大产量分别为312.5和174mg/g,分别是传统提取方法产量的2.3和2.5倍。

合成生物学使能技术的研究进展

作为一门拥有巨大潜力的新兴工程学科,合成生物学的发展主要得益于各种使能技术(enabling technology)的创新开发与应用.从基本功能元件的构建与标准化,到高通量的微芯片基因合成技术与各种尺度(从bp至Mb)的DNA拼接组装方法,再到强大的基因组编辑工具,在过去十几年里合成生物学使能技术取得了长足的进步.同时,新颖的使能技术也为遗传学、癌症治疗、疾病监测以及生物制造等领域提供了优秀的研究工具,促进了多个学科的发展.如果将这些使能技术作为"配件工具",那么相对应的"主体设备"——底盘细胞也因工具的不断创新得到了快速发展.微生物最小基因组的分析以及对基因组的连续删简优化,为构建一个具有可预测、可控制表型的优良底盘细胞奠定了基础.为促进基于细胞疗法的人类疾病治疗,哺乳动物细胞作为底盘细胞也正在开发中.本文对合成生物学使能技术的最新发展进行了深入总结和梳理,探讨了这些使能技术在合成生物学乃至整个生命科学研究中的应用及其重要意义.

萜类合成生物学研究进展

萜类合成生物学的研究已经使萜类微生物异源合成显示出了巨大的应用潜力.但由于植物源萜类代谢的复杂性,大量萜类合成途径仍未获得完全解析.因此当前大部分萜类仅能通过微生物异源合成获得非常简单的中间体,并且大多数产物的产量仍然较低,通常局限在毫克每升的水平.针对以上2个亟待突破的瓶颈,本文将从萜类合成途径解析与下游途径装配,高产萜类底盘细胞设计与构建,以及萜类异源合成系统的适配性研究3个方面阐述萜类合成生物学研究的最新策略与进展.

过表达丹参GGPPS研究丹参酮类的生物合成途径

丹参酮是药用植物丹参(Salvia miltiorrhiza)中具有较强生物活性的脂溶性二萜醌类化合物,是目前国际上广泛认可的有效治疗心脑血管疾病的天然药物之一.本研究通过分析过表达萜类生物合成途径中的牻牛儿基牻牛儿基焦磷酸合酶(GGPPS)的转基因丹参,发现丹参酮类化合物与叶绿素具有共同的上游生物合成途径,而下游途径因组织的特异化而不同,从而生成不同的代谢产物.通过对丹参毛状根外施两个萜类生物合成途径的抑制剂Lovastatin和Fosmidomycin,在处理6周丹参酮积累达到稳定时测定丹参酮的含量,探明了丹参酮类的生物合成主要是通过质体中的MEP途径来完成,而非胞质中的MVA途径.本研究为丹参酮类的代谢生物学及合成生物学研究提供了证据和基础.

新功能生物元器件的筛选、设计与功能鉴定

合成生物学与基因工程、代谢工程最显著的区别，在于能够将大量生物元器件进行快速、随意的组装，而实现这一目标的前提，是将生物元件或器件进行详细地功能表征与标准化。目前合成生物学面临的主要挑战之一，是可用的生物元件和模块（器件）种类局限、数量不足、表征描述不清楚、通用性程度不高。为此，有必要在功能元件的挖掘、表征、设计、改造与标准化方面开展系统研究。文章对重要天然产物合成途径的生物元件进行了挖掘与功能表征，并对氧化还原代谢的功能元件进行了设计与改造。

核糖体工程技术选育米尔贝霉素高产菌株

本实验室中保存的一株从土壤中分离得到的米尔贝链霉菌(Streptomyces milbemycinicus)27号菌株所产米尔贝霉素A3和A4的初始产量分别为61.0和23.8μg/m L。以该菌株为出发菌株,采用核糖体工程技术,结合紫外诱变技术,对米尔贝霉素产生菌米尔贝链霉菌进行诱变,并以链霉素耐受为筛选压力进行筛选。经过诱变后对单菌落进行摇瓶复筛,其中正突变株中米尔贝霉素产量最高的菌株编号是R2-6-5,其米尔贝霉素A3和A4的产量分别是105.2和38.8μg/m L,较原始菌株分别提高了72.5%和63.3%,且遗传稳定。最后,对产量变化较大的11株突变株基因组中rsm G基因和rsp L基因进行突变位点分析,发现在rsp L基因内均未发生突变,rsm G基因均发生突变。本研究表明,链霉素抗性降低的突变菌株确实都在相关基因内发生突变,且核糖体工程结合紫外诱变的诱变方式效果良好,能够快速有效的提高米尔贝链霉菌生物合成米尔贝霉素的能力。

链霉菌次级代谢调控相关的双组分系统研究进展

链霉菌具有强大的次级代谢能力,能够产生众多具有生物活性的次级代谢产物,如目前广泛应用的抗生素、抗肿瘤药物以及免疫抑制剂等。在链霉菌中,次级代谢产物的生物合成受到包括途径特异性、多效性以及全局性调控基因在内的多层次严格调控。关键调控基因的缺失或过表达可以显著影响次级代谢产物的生物合成,提示对于链霉菌次级代谢重要调控基因的功能及其作用机制的研究具有巨大的潜在应用价值。其中,作为细菌信号传导系统的双组分系统(Two-component system,TCS)一直是大家研究的关注点。越来越多的研究表明TCS在链霉菌次级代谢过程中发挥着全局性的调控功能。本文重点介绍链霉菌模式菌株——天蓝色链霉菌中TCS参与次级代谢调控的研究进展。这些TCS的功能鉴定及机制解析为工业链霉菌的定向遗传改造以提高重要次级代谢产物的含量提供了理论依据。

鲍曼不动杆菌遗传操作系统研究进展

鲍曼不动杆菌作为一种医院内感染的病原菌,因其易于引起各类感染且耐药性强而受到广泛关注。快速改造鲍曼不动杆菌基因组的工具可有效促进其耐药机制的研究。本文就近些年来适用于鲍曼不动杆菌的遗传操作方法进行了总结,包括各种外源基因转入方法(电转化、自然转化、接合转移)和基因改造技术(等位基因交换、DNA重组工程、转座突变),并对鲍曼不动杆菌的基因组编辑方法的改进作了初步展望。

基因组的设计与工程化构建

合成生物学是利用工程化的思想来设计和构建新的生物基因组,是近年来的研究热点。近年来,对原核细胞支原体天然小基因组进行从头合成并进一步设计与构建最小基因组,对原核模式生物大肠杆菌基因组的不断删减及全基因组密码子简约化设计与人工合成测试,以及对真核模式生物酿酒酵母基因组人工设计与合成测试都取得了很大成功,极大地促进了我们对生命的理解。我国的基因组的设计与工程化构建方面的研究虽然起步较晚,但近年来取得了国际瞩目的成果。基因组的设计与构建为深入了解生命起源与进化,并为进一步构建具有强大应用功能的新型生命体奠定了基础。

大肠杆菌异源生产丁醇途径组装及启动子优化

启动子优化是合成生物学研究的重要工具,可以通过不同强度的启动子调控基因转录水平以优化生物途径。丁醇是一种多用途的基础化工原料,目前有很多代谢工程手段应用在大肠杆菌的丁醇异源表达中,但是并没有进行启动子的精细调控。文中以大肠杆菌为宿主构建异源丁醇合成途径,通过DNA assembler的方法一步组装不同强度启动子组合的丁醇合成途径以优化丁醇合成。以强启动子Alper PLTetO1或弱启动子Alper BB转录硫解酶,以强启动子Braatsch 20或弱启动子Braatsch 10转录丁醇合成操纵子,共构建成4种不同质粒。结果表明以AlperPLTetO1转录硫解酶,Braatsch 10转录丁醇合成操纵子的组合获得最高的丁醇产量28 mg/L,与其他组合相比丁醇产量提高了3~5倍。

基于基因组编辑技术的大片段克隆新策略

基因组大片段克隆技术是合成生物学研究领域关键的使能技术。传统的大片段克隆技术获取目的大片段的手段存在各种缺陷,比如随机建库克隆需要依靠高通量筛选;PCR难以扩增10 kb以上片段,从小片段拼装费时费力且突变率高;基于限制性酶切连接难以找到片段两端适宜的限制性内切酶酶切位点。最近全基因组合成等前沿研究创造了全新的高性能大片段克隆方法,比如CRISPR/cas9系统中cas9可识别并切割20 bp核酸序列解决了识别位点设计难题,可用来获取任意目的基因片段;组合Gibson或者酵母偶联重组技术组装技术,可高效克隆大片段基因。本文将分类介绍基因组大片段克隆技术,并提出适用不同尺度大小基因克隆的技术选择参考标准。